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流感病毒NS1蛋白是一个多功能蛋白,能够抵御或抑制宿主细胞由于病毒感染所激活的干扰素系统等免疫反应,有利于流感病毒完成其复制周期。作为一个多功能蛋白,NS1蛋白在细胞内不同的区域中行使着不同的功能,它的细胞内定位和动态对病毒完成其复制周期和病毒的毒性有重要的影响。目前已报到的和NS1定位相关的序列包括两个核定位信号,一个包含在C端的核定位信号中的核仁定位信号,一个核输出信号和核输出信号的抑制序列。
在本研究中,作者发现,来源于A/PR/8/34和A/Sydney/5/97两个毒株的NS1蛋白,当它们融合到加强绿色荧光蛋白(EGFP)的C端以融合蛋白的方式在MDCK细胞中瞬时表达时,在细胞中的定位不同。然后,通过构建NS1蛋白突变体,并融合到绿色荧光蛋白C端后,在荧光显微镜下观察EGFP-突变NS1( EGFP-mtNS1)融合蛋白在细胞质中的定位,鉴定发现第221位氨基酸残基是NS1蛋白C端的核定位信号和核仁定位信号中一个新的关键氨基酸,它对NS1蛋白的核定位和核仁定位都是必需的。同时,研究了NS1蛋白C端的核定位信号中不同的碱性氨基酸对NS1蛋白核定位和核仁定位的不同贡献,发现第221位碱性氨基酸最重要,第229位碱性氨基酸重要性最小;而通过不同毒株NS1蛋白的拼接融合和突变分析,还发现:当NS1蛋白在MDCK细胞中瞬时表达时,其上CPSF的结合位点对其细胞内的定位有影响,与CPSF因子结合功能的丧失能够增加NS1蛋白的细胞质定位。另外,使用Crml介导的出核路径特异性抑制药物LMB对瞬时表达NS1蛋白的细胞进行处理,发现NS1蛋白的出核是对LMB不敏感。最后,通过荧光漂白后恢复实验,发现NS1蛋白在细胞核核质和细胞核核仁中都是在运动的,并分析计算出EGFP-NS1(A/Sydney/5/97)融合蛋白在细胞核核质和细胞核核仁的有效扩散系数分别为0.023±0.010μm2/S和0.0031±0.0006μm2/s。
本论文利用GFP荧光蛋白标签在活细胞中研究A型流感病毒NS1蛋白的细胞内定位和动态,并且结合突变体构建鉴定出多个NS1蛋白细胞内定位相关的重要位点。本实验对NS1蛋白细胞内定位的研究有助于理解和预测来自不同毒株的NS1蛋白在细胞内的定位和动态模式。这些结果为进一步了解NS1蛋白在A型流感病毒毒性中所起的作用提供了新的线索。