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流行性感冒(流感)为临床常见病和多发病,其中以甲型流感(甲流)对人类的健康的影响最为严重,且近几年致病呈活跃势态。由于岭南地区独特的地理气候环境及饮食习惯,导致岭南地区呼吸道病毒感染性疾病常见湿热证候。温病湿热证“热得湿而愈炽,湿得热而愈横”,湿热为患,如油入面,难分难解。湿邪的产生与水液代谢紊乱相关,水通道蛋白(aquaporin,AQP)是调节水液代谢的重要物质之一;热邪致病,常导致机体产生炎症反应、免疫紊乱,而炎症免疫因子白介素-6(Interleukin6, IL-6)、肿瘤坏死因子a(Tumor Necrosis Factor-a,TNF-a)常常与此相关。本实验冀通过比较研究法观察流感湿热证小鼠炎症免疫及水液代谢的变化,以及蒿芩清胆汤及其拆方对此的干预作用,以期探讨湿热证产生的物质基础,以及湿热证“湿”、“热”偏盛的衡量指标,反证分消走泄法对湿热证的调节机制。 目的: 本研究以肥甘饮食+内外湿热环境+甲型流感病毒 H1N1滴鼻建立流感湿热证小鼠模型,观察内外湿热环境对流感小鼠肺组织流感病毒 H1N1、AQP1、IL-6、TNF-a表达的影响,探讨湿热证产生的物质基础,以及湿热证“湿”、“热”偏盛的衡量指标;同时,通过观察蒿芩清胆汤及其拆方对流感湿热证小鼠肺组织流感病毒 H1N1、AQP1、IL-6、TNF-a表达的影响,探讨分消走泄法治疗流感湿热证的机制和作用靶点。 方法: 1.湿热因素对流感湿热证小鼠炎症免疫及水液代谢的影响作用 28只BALB/c小鼠(4周龄)随机分为4组:正常对照组、湿热组(湿热环境+肥甘饮食)、病毒组(甲型流感病毒 H1N1滴鼻感染)、模型组(湿热环境+肥甘饮食+甲型流感病毒 H1N1滴鼻感染),观察小鼠症状、体征,测量小鼠肛温、进食量、饮水量,处死后计算小鼠肺指数,FQ-PCR法检测各组小鼠肺组织流感病毒、AQP1、IL-6、TNF-a的表达,免疫组化法检测各组小鼠肺组织AQP1表达,酶联免疫反应法检测各组小鼠肺组织IL-6、TNF-a表达。 2.分消走泄法对小鼠流感湿热证炎症免疫及水通道蛋白的调节作用 42只BALB/c小鼠随机分为6组:正常对照组、模型组、利巴韦林组、蒿芩清胆汤组、拆方1组、拆方2组,观察各组小鼠症状、体征,测量小鼠肛温、进食量、饮水量,处死后计算小鼠肺指数,FQ-PCR法检测各组小鼠肺组织流感病毒、AQP1、IL-6、TNF-a的表达,免疫组化法检测各组小鼠肺组织AQP1表达,酶联免疫反应法检测各组小鼠肺组织IL-6、TNF-a表达。 结果: 1在肥甘饮食+湿热环境+甲型流感病毒H1N1滴鼻感染多重因素干预下,模型组小鼠出现发热、进食量及饮水量减少、倦怠、肛周污秽,大便溏烂,小便黄等湿热证候;而单纯病毒组小鼠则出现发热,热势偏高,进食量减少,饮水量增加,懒动,大便干,小便黄等热偏盛证候。 2模型组小鼠肛温升高、进食量、饮水量均减少,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);湿热组小鼠进食量减少,与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05);病毒组小鼠肛温升高,进食量减少,与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05),病毒组小鼠饮水量增加,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。 3肥甘饮食+湿热环境+甲型流感病毒H1N1滴鼻感染复合因素干预下,模型组小鼠肺指数下降,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),与病毒组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。模型组小鼠流感病毒表达水平与病毒组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 4模型组小鼠与病毒组小鼠肺组织IL-6、TNF-a表达均出现异常,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);模型组小鼠肺组织AQP1表达量明显下降,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);病毒组小鼠肺AQP1表达量与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 5蒿芩清胆汤治疗后,小鼠肺指数下降、流感病毒复制量、肺组织 AQP1、IL-6、TNF-a的表达均明显下降,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);肺组织AQP1的表达水平方面,利巴韦林组与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05),而肺指数、H1N1mRNA表达、肺IL-6、TNF-a的表达与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05);拆方1组小鼠出现肛温升高、饮水量增加,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);拆方2组小鼠出现进食量、饮水量均减少,与对照比较,差异有统计学意义(P<0.01)。 6模型组小鼠经治疗后,各组小鼠出现不同的证候转归,蒿芩清胆汤组小鼠表现为湿热分消而解,逐渐恢复正常的证候表现;拆方1组小鼠出现热偏盛证候表现;拆方2组小鼠出现湿偏重证候表现;而利巴韦林组小鼠虽体温下降,进食量、饮水量等与蒿芩清胆汤组小鼠相当,但小鼠却出现疲倦少动、反应迟钝,便溏,为气虚症候表现。 结论: 1单纯病毒感染小鼠肛温高于流感湿热证小鼠,考虑这与湿热致病“起病缓慢,热势不显,病程缠绵”相关;湿热因素在一定程度上影响了流感疾病的证候转归。 2流感湿热证模型小鼠肺指数升高、肺水通道蛋白AQP1、IL-6及TNF-a的表达均出现异常,说明水液代谢紊乱,炎症反应、肺组织免疫损伤是湿热证的物质基础之一。 3模型组小鼠肺组织AQP1表达水平低于病毒组小鼠,而病毒组小鼠IL-6、TNF-a表达平均值高于模型组小鼠,对比三种因素对小鼠水液代谢及免疫功能的影响,结合两组小鼠中医证候考虑,认为 AQP1的表达水平与中医“湿”证相关,IL-6、TNF-a的表达水平跟中医“热”证相关,并且随着“湿”、“热”证候的发展而变化。 4拆方1组、拆方2组治疗后分别出现热偏盛、湿偏盛的证候转归,反证了湿热证“徒清热而湿愈盛,徒祛湿而热愈炽”的观点;反证了IL-6、TNF-a可作为衡量湿热证“热”偏盛的微观指标之一,AQP1可作为衡量湿热证“湿”偏盛的微观指标之一。 5结合宏观与微观研究,利巴韦林在微观指标的改善方面接近蒿芩清胆汤,但临床症状改善不明显,蒿芩清胆汤疗效优于其拆方及利巴韦林,分消走泄法治疗流感湿热证疗效确切。蒿芩清胆汤治疗流感湿热证是多靶点、整体调节的综合结果,抑制流感病毒复制、调节水液代谢、平衡机体免疫功能、减轻炎症损伤是蒿芩清胆汤治疗流感湿热证的证治机理之一。