辣椒PSY基因家族分析及CaPSY1功能研究

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八氢番茄红素合成酶(PSY,phytoene synthase)是类胡萝卜素合成途径的第一个限制酶,在果实发育中起着重要的作用。然而,CaPSY基因在果实成熟过程中基因组范围内的表达模式还不清楚。本研究中,对辣椒中PSY基因家族进行了鉴定,并用生物信息学方法对PSY基因家族进行了分析,并对其与非生物胁迫之间的关系进行了研究。为探究CaPSY1基因在辣椒果实中的作用,构建了GFP荧光定位载体分析其定位情况;还构建了VIGS-CaPSY1沉默载体,在辣椒转色期沉默果实CaPSY1基因,分析其表型及相关基因表达量;还构建了过表达载体,在拟南芥中遗传转化。结果如下:  (1)通过已公布的辣椒遵辣1号基因组数据库,运用Pfam数据库和Blast等技术,在辣椒中共鉴定出3个同源PSY基因,对其命名CaPSY1、CaPSY2.a和CaPSY2.b。通过生物信息学分析,发现3个PSY基因中都只含有5个内含子,并且在其蛋白序列中发现8个motif,PSY基因的活性位点DXXXD只存在于motif2和motif3中。在对单子叶和双子叶植物中PSY基因进化关系的研究中,发现CaPSY1和SlPSY1聚集在一起,CaPSY2.a和SlPSY3聚集在一起,CaPSY2.b和SlPSY2聚集在一起。还发现PSY基因家族在单子叶和双子叶植物进化过程中具有分歧,经历了不同的进化过程。  (2)对PSY基因家族在不同组织和果实发育过程中转录组数据进行分析后,发现CaPSY1基因表达量在青果时期较低,随着果实发育进程表达量一直上调,在果实发育第8个时期达到最高。CaPSY2.a在根、茎、叶、花、果实发育第3和第7个时期不表达。CaPSY2.b在各个组织中都有表达。这表明CaPSY基因家族在植物体内有不同的功能,并且表达模式具有组织特异性。用荧光定量方法对PSY基因在果实发育中表达模式进行了验证,发现结果与转录组数据一致。还研究PSY基因在5种不同果色(绿色、白色、红色、黄色和紫色)中的表达模式,发现CaPSY1基因在黄色和红色中表达量较高,但是CaPSY2.a和CaPSY2.b在黄色和红色中表达量较低,推测辣椒果实发育过程中起主要作用的应该是CaPSY1基因。  (3)为了探究PSY基因与非生物胁迫之间的关系,对辣椒进行脱落酸、低温和高温处理,在处理后0、2、6、12、24和48小时的样品进行荧光定量检测。结果发现,CaPSY1和CaPSY2.b对胁迫都有应激反应,CaPSY1和CaPSY2.b在ABA胁迫下,先下调表达后上调表达。  (4)CaPSY1基因沉默辣椒果实与对照相比,实验组颜色变为橙色,对照组仍然是红色。荧光定量检测结果发现实验组CaPSY1基因表达量降低,类胡萝卜素合成相关基团也发生了变化。并且实验组中叶黄素的含量增加,可能是导致辣椒果实变为橙色的主要原因。  (5)构建CaPSY基因过表达载体,在拟南芥中遗传转化,发现转基因拟南芥出现矮化症状,类胡萝卜素合成相关基因表达量升高,但是叶绿素含量降低。
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