一、研究背景和目的胶质瘤是神经系统最常见的原发性肿瘤,病死率高,严重威胁人类健康。胶质瘤的治疗方法主要为手术后辅以放疗和化疗等综合治疗,但总体预后仍不理想,5年生存率低。据统计,恶性脑肿瘤占人类所有癌症患者的2%,占儿童全身肿瘤发病率的20%-25%,综合发病年龄高峰在30-40岁,或10-20岁。其中又以胶质细胞瘤发病率最高,约占恶性脑肿瘤40.49%。胶质母细胞瘤患者从确诊开始的中间生存时间是15个月,由于胶质细胞瘤分化不全、且深入神经细胞深处,常规的抗肿瘤措施,包括手术、放疗和化疗都很难有效根除,导致其复发率较高。这与胶质瘤本身的生物学特性密切相关。胶质瘤呈浸润性生长,与周围正常脑组织之间无明显界限,手术难以做到将肿瘤全切除,而血脑屏障的存在以及胶质瘤对大部分细胞毒性药物的高度耐药使得传统化疗作用也非常有限。尽管显微手术技术有了很大的进步,手术的安全切除范围也得到进一步扩大,相关并发症有了明显的下降,术后放疗的常规应用以及新一代的口服化疗药如替莫唑胺的普及在一定程度上提高了患者术后生存期。但这些技术上的进步对于恶性胶质瘤患者的总体预后并无非常明显的改善,其最大难点仍在于复发。有鉴于此,恶性胶质瘤的治疗和控制一直是神经外科临床和科研工作中的重点和难点内容之一,对于其新的辅助治疗方法的探索,以期有效抑制或延缓肿瘤复发具有重要的科学和社会意义。研究发现,在脑胶质瘤中存在一种数量极少具有干细胞特性的细胞,正是这类细胞导致胶质瘤产生和复发,这类细胞已经被定义为脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cells, BTSCs)。BTSCs存在于恶性脑胶质瘤的事实最早由Ignatova等(2002年)报道,他们将脑胶质瘤细胞在神经干细胞(neural stem cells, NSCs)培养条件下进行培养,结果发现有克隆形成,其细胞表达NSCs标志物Nestin,分化细胞则同时或单独表达神经元特异性烯醇化酶(neurone specific enolase,NSE)、神经胶质细胞纤维酸性蛋白(glial fibrILlary acidic protein, GFAP)和神经元β-Ⅲ微管蛋白(neuronal beta-Ⅲ tubulin)等并有基因转录,提示这类细胞具有NSCs特性,具有分化为神经元样和胶质细胞样细胞的能力,因而把这类细胞称为肿瘤干细胞样细胞(tumor stem-like cells),并认为其与肿瘤起源和生长有关。此后,又有Singh等(2004年)发现,脑肿瘤中几乎所有的细胞增殖均由一小部分表达人类干细胞标志物CD133的细胞即BTSCs产生。在培养基中,这些细胞可以增殖并分化为神经元和(或)胶质细胞,比例、表型与原肿瘤一致。这些新生的肿瘤细胞又可以在培养基中产生新的肿瘤细胞,证明它们是肿瘤细胞而不是被肿瘤样本污染的正常NSCs。Hemmati等(2003年)对小儿髓母细胞瘤和胶质瘤进行研究,也发现存在与NSCs性质相似的细胞,它们在体外可形成神经球,能够自我更新,且具有多分化潜能,在一定环境中可分化成具有神经元和/或胶质细胞表面标志的细胞,细胞比例与原肿瘤相似,提示其参与了脑肿瘤的形成；与正常NSCs不同的是,这些细胞在异体原位移植后,可以分化为与原肿瘤相似表型和核型的肿瘤。CD4+CD25调节性T细胞(Regulatory T-cells, Treg细胞)是近年来发现的一群通过细胞间接触并产生抑制性细胞因子而发挥免疫负调控功能的T细胞亚群,1995年由Sakaguchi首次报道。Treg细胞具有低反应性和免疫抑制性两大功能,对维持机体免疫稳态发挥着重要作用。Treg细胞在抑制效应性T细胞功能的同时、也降低机体对肿瘤细胞的免疫反应,间接促进肿瘤细胞的生长,在肿瘤细胞免疫逃逸过程中扮演重要角色。在多种恶性肿瘤组织中(如乳腺癌,卵巢癌,肺癌,肝癌,恶性淋巴瘤等)都有大量Treg细胞浸润,其在患者外周血淋巴细胞中的比例也明显升高。并且,Treg细胞的数量与肿瘤的发展呈正相关、而与肿瘤的预后呈负相关,因此,清除Treg细胞或抑制Treg细胞功能将有助于机体抗肿瘤免疫功能的恢复。叉状头/翅膀状螺旋转录因子(forkhead/winged helix transcription factor, FOXP3)在Treg细胞上特异性表达,是控制Treg发育及其功能效应的关键基因。Th17细胞则是辅助性T细胞亚群的新成员。Thl7细胞最初被发现于自身免疫性疾病,它们表达CD4和IL-17。初始CD4+T细胞可在TGF-β和IL-6影响下,依赖转录因子RORγt而分化为Thl7细胞,IL-23,IL-1β等细胞因子也被认为与该亚群细胞分化及功能有关。研究还表明,Th17细胞在感染和自身免疫性疾病中,主要通过表达IL-17及诱导趋化因而诱发感染和持续炎症等病理过程；同时,该群细胞还具有促肿瘤生长的生物学作用,目前已知Thl7细胞主要经其效应分子IL-17通过以下几种方式促进肿瘤的发生发展：(1)上调VEGF、CD31等因子表达,从而促进血管增生,加速肿瘤生长;(2)上调IL-6、STAT3信号途径,并由此促进肿瘤进展;(3)下调Thl表面IL-12R β分子表达,从而下调Thl细胞功能、抵抗有效肿瘤免疫;(4)使CD8+细胞共表达IL-17,从而使CD8+细胞失去细胞毒效应,发挥抗凋亡作用。由此可知,BTSCs与脑胶质瘤的发生、发展、复发具有密不可分的关联性,而Treg细胞及Th17细胞也通过相关免疫机制或炎性机制而促进肿瘤的发生发展。那么,在Treg细胞与Thl7细胞之间、BTSCs细胞和Treg细胞之间、BTSCs细胞与Thl7细胞之间等究竟存在着怎样的关系?BTSCs是否通过Treg或Treg细胞而导致胶质瘤免疫耐受?目前的研究发现,介导免疫耐受的Treg细胞和介导炎症反应的Thl7细胞之间,其功能和分化过程常呈相互对抗状态。机体处于正常状态下,两者可保持相对的平衡：一旦出现机体功能异常,则时常表现出Treg/Thl7的功能与分化过程失衡。另有研究表明,由活化树突状细胞分泌的细胞因子IL-6是决定初始CD4+T细胞向Treg细胞或是Th17细胞方向分化的关键因子。还有研究显示,孤独核受体RORyt(一种核激素受体超家族成员)是Th17细胞分化中主要的转录因子,而Foxp3作为Treg的重要标志性分子,其全长亚型可与RORyt结合从而抑制RORyt的功能、减少RORyt对IL-17在Th17细胞内的表达抑制作用。已知Thl7细胞与Treg细胞在相同肿瘤中的数量呈负相关,表明在肿瘤微环境中,Th17细胞与Treg细胞存在着相互作用。有报道称,小鼠周围神经的成熟Treg细胞可被转化为Thl7细胞,尤以感染和IL-6产生过程中容易发生该类现象。另有报道指出,肿瘤相关Treg细胞表达高水平的CD39,后者是一种外核苷酸酶,可将ATP转换为腺苷、从而通过腺苷通路抑制Th17细胞的激活。也有报道称,小鼠Treg细胞可阻止Th17细胞反应。如果Th17细胞介导免疫防御,那么,阻止Th17细胞发展可逃避免疫系统的防御反应。目前国内外关于胶质瘤、Treg和Th17细胞三者之间的研究还很少,最近的一篇报道表明,胶质瘤内Th17和Treg细胞均可以随着时间的推移而增多,并且Th17细胞的极化可以通过Treg细胞和胶质瘤微环境内的细胞因子作用完成,提示胶质瘤组织内的Thl7细胞和Treg细胞均有重要的免疫作用。既然Treg细胞及Th17细胞之间具有相互作用、并且通过相关免疫机制或炎性机制而促进肿瘤的发生发展,而BTSCs在胶质瘤的发生发展中又占有重要的源头性作用地位(BTSCs通常被认为是胶质瘤的启动细胞),因此,本研究针对胶质瘤中的BTSCs与同个体Treg或Th17细胞的关系进行了初步探讨。我们通过同步分析胶质瘤模型大鼠及胶质瘤标本来源个体的BTSCs特点、这些BTSCs与同个体Treg细胞或Th17细胞特点的相关性,以及在它们并存与否情况下对胶质瘤发生发展、恶性度乃至个体生存期的影响等,试图深入分析BTSCs在胶质瘤相关免疫环境中所处的作用地位。二、方法本研究分为三部分。第一部分：BTSCs分离纯化及特性收集术中胶质瘤标本(分级按WHO标准),经过剪切修整、常规胰酶消化等步骤获取游离的胶质瘤组织细胞,以DMEM/F12培养基加胎牛血清原代培养,至第3-5天取部分原代细胞、并以流式细胞仪检测其中CD133阳性细胞的表达率。再通过无血清培养法(DMEM/F12培养基加B27、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)连续分别培养人原代胶质瘤细胞和大鼠胶质瘤细胞系(9L),经10-20天左右培养出悬浮的肿瘤球(即BTSCs球),再经免疫细胞染色和流式细胞检测等方法,验证这些肿瘤球表达CD133和Nestin表面标志物的情况。CCK-8检测这些细胞的生存情况。通过立体定向手术,将大鼠胶质瘤细胞分别移植到F344或Wistar大鼠脑内或者皮下,观察移植后大鼠的生存期和皮下肿瘤生长大小的情况。第二部分：BTSCs与Treg细胞及其相关细胞因子在第一部分实验构建原位胶质瘤动物模型基础上,以CD4+和CD4+FOXP3+淋巴细胞在外周血的表达率为评估指标,用流式细胞计数仪、检测外周血中的Treg细胞含量,并通过酶联免疫法(ELISA)检测外周血细胞因子(如IL-10,IL-6,TGF-β, IFN-γ等)的表达情况。在建立模型后第17天,处死模型鼠,取出胶质瘤组织,制备组织切片,利用免疫组化检测肿瘤组织中Foxp3、CD133和Mestin的蛋白表达；通过定量PCR的方法检测肿瘤组织中Foxp3、CD133和Nestin的基因表达。收集人源胶质瘤标本、并抽取患者外周血,在荧光定量PCR检测肿瘤组织中Foxp3、CD133和Nestin基因表达的同时,同步以流式细胞计数仪对脑胶质瘤患者外周血单个核细胞中CD4+Foxp3细胞的含量进行检测、并评定外周血中Treg细胞的含量。第三部分：BTSCs与Th17细胞及其相关因子在第一部分构建原位胶质瘤动物模型的基础上,通过流式细胞计数仪检测模型鼠外周血中CD4+IL17细胞在CD4细胞中的表达率,以验证Th17细胞的阳性率,并通过酶联免疫法(ELISA)检测外周血中的细胞因子(如IL-17和IL-23等与Th17相关的细胞因子)表达情况。在建立模型后第17天,处死模型鼠,取出胶质瘤组织,制备组织切片,利用免疫组化检测肿瘤组织中IL-17、CD133和Nestin的蛋白表达；通过定量PCR检测肿瘤组织中IL-17、CD133和Nestin的基因表达。收集人源胶质瘤标本,并抽取患者外周血,流式细胞计数仪检测外周血Th17细胞含量(以CD4+IL17+细胞在CD4+细胞中的百分率为评估指标)同步以荧光定量PCR检测肿瘤组织中IL-17、CD133和Nestin的基因表达。统计学处理：全部数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,常规进行方差齐性检验、正态性检验。计量资料实验数据以均数±标准差(x±SD或mean±SD)表示。生存周期采用Kaplan-Meier方法分析,Cox模型被用于分析胶质瘤患者的病理分级、年龄和性别。单变量两组资料之间的比较采用t检验,多组资料之间的比较采用单因素方差分析,并用LSD法做多重比较,以P<0.05为统计学有显著性差异。三、结果1、BTSCs我们成功地从原代胶质瘤组织中以及9L细胞系中分离出肿瘤细胞球(即BTSCs球),这些BTSCs球均在无血清培养环境下培养形成。免疫细胞化学检测证明,这些肿瘤球均阳性表达CD133(?)Nestin等BTSCs的标记蛋白(图1-2)；将这些肿瘤球放入普通血清培养环境后,肿瘤球贴壁生长,且主要表达GFAP或NSE蛋白(图1-3)。将普通的大鼠胶质瘤细胞和能形成肿瘤球的胶质瘤细胞分别植入大鼠脑内后,观察发现,种植肿瘤球的大鼠中位生存时间(22.00±0.557天)要比种植普通胶质瘤细胞的大鼠中位生存时间(27.00±2.309天)短(图1-6)。同时发现,种植普通胶质瘤细胞的大鼠的神经症状如癫痫发作、偏瘫等发生也较晚。皮下种植胶质瘤的大鼠,在种植后第21天处死,取出肿瘤,经测量体积、统计分析后发现,用肿瘤球种植的大鼠,最后肿瘤的平均体积都较大(平均1665.50±184.304mm3)；而用普通胶质瘤细胞种植的相对较小(平均1218.75±106.456mm3)(图1-6,表1-4)。对人源胶质瘤标本形成肿瘤球的情况、和患者生存时间同步平行分析后发现,能在体外培养过程中形成肿瘤球的患者,其生存期较短(图1-4,表1-2,1-3)2、BTSCs和Treg细胞及其相关细胞因子针对动物标本：ELISA检测显示,外周血的IL-10和TGF-β在原位胶质瘤大鼠模型中,相比正常健康对照大鼠,均有显著差异(图2-2,2-3)。同时,在外周血TGF-β的表达方面,以普通胶质瘤细胞制备的大鼠模型与由肿瘤球制备的大鼠模型相比,有显著差异。流式细胞检测结果表明,正常大鼠的外周血CD4+Foxp3细胞数量(6.24±1.832%),与原位胶质瘤模型鼠的该类细胞数量(9.82±2.663%)相比有显著差异。移植普通胶质瘤细胞的模型鼠与移植肿瘤球的模型鼠相比,外周血CD4+Foxp3+细胞的数量(8.12±2.493%vs.11.52±2.663%)也有显著差异(图2-1)。免疫组化检测表明,在模型鼠肿瘤组织中均有CD4+Foxp3+细胞的存在(图2-4,2-6)。针对人源标本：流式细胞检测显示,与正常成人对照相比、胶质瘤患者外周血中CD4+Foxp3细胞的数量增高(4.640±0.817%vs8.713±2.178%),二者之间有显著差异(图2-8)。定量PCR检测证实,人胶质瘤组织中存在CD4+Foxp3细胞,并且胶质瘤组织中Foxp3的表达显著高于对照组；同时CD133和Nestin的表达,胶质瘤组也显著高于对照组(图2-9,2-10)3、BTSCs和Th17细胞及其相关细胞因子针对动物标本：ELISA检测显示,外周血的IL-17和IL-23在原位胶质瘤大鼠模型中,相比正常健康对照大鼠,无显著差异(图3-2,3-3)。流式细胞检测结果表明,正常大鼠外周血中CD4+IL-17+细胞在CD4+T细胞亚群中的数量,与原位胶质瘤模型鼠相比无显著差异(图3-1)。免疫组化检测结果表明,在模型鼠肿瘤组织中均有CD4+IL-17+细胞的存在(图3-4)。定量PCR也证实了胶质瘤组织中有IL-17的表达。针对人源标本：流式细胞检测显示,与正常成人对照相比、胶质瘤患者外周血中CD4+IL-17+细胞的数量无显著差异(图2-8)。定量PCR检测结果显示,人胶质瘤组织中有IL-17的表达,但是与对照组相比两者差异未见统计学意义(见图2-9,2-10)。四、结论1、与肿瘤球(BTSCs球)阴性的个体相比,肿瘤球(BTSCs球)阳性的荷胶质瘤大鼠及胶质瘤患者生存期明显缩短。2、与肿瘤球(BTSCs球)阴性的个体相比,肿瘤球(BTSCs球)阳性的荷胶质瘤大鼠及胶质瘤病员外周围血Treg细胞数量增多,且在随着BTSCs增多而增多的同时、免疫耐受相关细胞因子TGF-β也显著升高。3、与肿瘤球(BTSCs球)阴性的个体相比,肿瘤球(BTSCs球)阳性的荷胶质瘤大鼠及胶质瘤病员外周血Th17细胞数目没有显著增多；与Thl7细胞免疫相关的细胞因子IL-17和IL-23表达,相比于对照组亦差异不显著。