背景:中医药治疗是中晚期肝癌的重要治疗策略,寻找和挖掘中医药治疗的优势人群和关键切入点是近年来研究的重点。林丽珠课题组长期致力于中医药治疗肝癌的临床研究,成功研制了疏肝祛瘀解毒法治疗方案和疏肝祛瘀解毒方,通过总结临床病例,证实可有效起到延长生存期,改善生活质量的作用。但疏肝祛瘀解毒方治疗中晚期肝癌的机制是什么?是否跟肝癌的预后存在一定联系,以上皆是需要待解决的问题。也许能为抑制肝癌的疾病进展提供新的可能。同时也为进一步研究中药干预肝癌预后提供一定的理论基础。目的:通过阅读文献和回顾性研究,初步建立肝癌的证候要素诊断量表,收集林丽珠教授辨治中晚期肝癌的门诊处方,分析提取疏肝祛瘀解毒法治疗肝癌的临床依据。利用网络药理学、分子对接和分子动力学技术,揭示疏肝祛瘀解毒方治疗肝癌的作用靶点,在生物信息学基础上构建预后模型。结合细胞实验揭示具体分子机制,为临床应用提供实验依据。方法:1基于证素对林丽珠教授门诊原发性肝癌患者临床研究（1）收集2015年1月-2018年12月门诊林丽珠教授论治原发性肝癌合格病例304例,将四诊信息筛选录入文锋Ⅲ辅助诊疗系统辨证软件,筛选规范化的四诊信息,录入后软件运算辨出证素。（2）运用中医传承计算平台3.0统计软件对患者四诊信息、证素进行频数统计,得到26条证素关联分析。2林丽珠教授论治中晚期肝癌的门诊处方规律研究回顾性分析林丽珠教授门诊347条处方,利用中医传承辅助计算平台3.0软件,对用药情况及功效、性味归经进行频次总结,对处方进行关联规则分析,最终归纳总结立法选方规律,并从中提取核心处方。另举例获得长期生存的案例以佐证。3基于网络药理学、分子对接和分子动力学的疏肝祛瘀解毒方治疗肝癌的分子靶点鉴定和机制研究通过在线中医药数据库联合R语言鉴定疏肝祛瘀解毒方治疗肝癌的分子靶点和机制,构建分子靶点网络筛选出可能发挥作用的核心靶点和化合物,进一步使用Autodock和Pymol软件等对其中的核心化合物和靶点进行分子对接和动力学模拟,验证结果的可靠性。4基于生物信息学的疏肝祛瘀解毒方治疗肝细胞癌的预后模型和列线图构建联合生物信息学,识别肝细胞癌发生发展密切相关基因,使用疏肝祛瘀解毒方治疗肝癌的靶点进行预后模型构建,并使用ROC曲线下的AUC面积评估了模型的可靠性。结合肝细胞癌患者的临床性状进行列线图的构建,以评估患者的预后情况。5疏肝祛瘀解毒方治疗肝癌的分子机制研究制备疏肝祛瘀解毒方浓缩液及含药血清,培养人肝癌细胞Hep G2和人正常肝细胞株LO2,进行细胞传代。分别完成细胞毒性实验、DAPI染色实验、Annexin V-FITC/PI双染实验、免疫荧光实验、Western blot实验。结果:1基于证素对林丽珠教授门诊原发性肝癌患者临床研究最终纳入304例临床病历,获得规范化的四诊信息,累计221种证候,累计2359频次,其中前5位的证候是“睡眠不实”、“倦怠乏力”、“口渴引饮”、“失眠”、“口苦”。常见舌象为淡红、暗红舌,薄白、黄、腻苔,脉象为弦脉。将症候进行逐一提取共获取证素38个,总频次为1223次,前10位依次为湿、热、肝、脑、阴虚、气虚、气滞、胃、脾、胆。其中排名病位证素为肝、神、胃、脾、胆等;病性证素为湿、热、阴虚、气虚、气滞等。证素关联分析前5位分别为湿+热、脑+阴虚、湿+肝、热+肝、热+阴虚。2林丽珠教授论治中晚期肝癌的门诊处方规律研究收集347条处方的总用药数为148味,总用药频次为5706次。高频药物分别为甘草、桃仁、土鳖虫、龙葵、山慈菇、肿节风、半枝莲等。最常用药物类别为:补虚类、清热类、活血化瘀类等。药物的四气进行统计,以寒、平、温为主;五味以苦、辛、甘为主。药物归经以肝脾为主。处方关联规则分析支持度较高的药组是甘草、桃仁、土鳖虫。3基于网络药理学、分子对接和分子动力学的疏肝祛瘀解毒方治疗肝癌的分子靶点鉴定和机制研究鉴定和机制研究GO富集分析示,可能通过对刺激的反应、细胞对刺激的反应和生物调节来实现。KEGG富集分析示,可能与PI3K-Akt信号通路,HTLV-I感染和Ras信号通路有关。同时AKT1、IL6、MAPK1和TP53是发挥作用的主要核心靶点,槲皮素可靶向上述的四个靶点,进一步的分子对接和分子动力学模拟分析表明槲皮素对AKT1和MAPK1的结合能最低,有可能成为潜在的核心化合物和靶点。4基于生物信息学的疏肝祛瘀解毒方治疗肝细胞癌的预后模型和列线图构建通过对疏肝祛瘀解毒方治疗肝细胞癌的靶点10个进行单因素cox分析联合LASSO回归进行预后模型的构建。结果模型低危险组中位生存期为5.8月,高危险组中位生存期为3.7月,其差异具有显著性意义,p=0.00189。预后模型的ROC曲线计算AUC面积,分别为1年0.74,3年0.679,5年0.635,说明该模型预测患者生存具有良好的效应。结合cox分析CCNB1和TNM分期是独立的预后危险因素。进一步构建列线图以估算CCNB1的表达水平、TNM分期与患者总体生存率的关系,结果显示C-index为:0.69（0.635-1）,p<0.001,说明该列线图用以评估患者的总体生存情况具有中等程度准确性。5疏肝祛瘀解毒方治疗肝癌的分子机制研究疏肝祛瘀解毒方对Ras/MAPK信号通路存在双向调节的作用,早期激活Ras/MAPK信号通路可诱导Hep G2的自噬,对细胞凋亡无明显影响;而其晚期抑制Ras/MAPK信号通路则可诱导Hep G2细胞凋亡,同时对自噬无明显影响。结论:通过总结分析林丽珠教授治疗中晚期肝癌的用药规律,化裁疏肝祛瘀解毒方。通过网络药理学及分子对接、分子动力学预测,验证疏肝祛瘀解毒方对Ras/MAPK信号通路具有双向调节作用,早期激活诱导肝癌细胞自噬性死亡,晚期抑制则诱导肝癌细胞凋亡,可能有效抑制肝癌耐药性的发生。