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目的:目前,全膝关节置换术（TKA）现已得到广泛应用,是治疗晚期膝关节病变的有效方法。然而,假体周围关节感染（PJI）是人工膝关节置换术中最“灾难性”的并发症,它会给患者带来巨大的疼痛,严重时甚至会导致截肢,早期诊断对PJI的治疗和预后非常重要。此时治疗相对容易,效果较好。因此,探索PJI的早期诊断方法是PJI诊断和治疗研究的重点之一。本研究以群体感应（QS）理论为指导,以革兰氏阴性菌的信号分子N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）为研究对象,探索了液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）检测感染周围组织中AHLs的方法,使用该检测方案初步探索在PJI引起的PA感染初期促进PA生物膜粘附效应的AHL类型,为了利用信号分子作为PJI的早期诊断方法,并通过干扰AHLs降低PJI治疗的难度,提供实验方法和证据。本研究分三部分:1.使用三种药物（穿心莲内酯、抗生素、AHLs水解酶）对体外培养的PA菌液的干预,分析三种药物抑制生物膜产生粘附效果的原因;2.创立在动物PJI模型感染组织周围AHLs进行LC-MS/MS检测的前处理方法及检测条件,并对该前处理方法及检测条件进行敏感性测试;3.通过观察PA引起的PJI动物模型中AHLs的量与关节假体上生物膜粘附在的量及生物膜形态的相关性,分析PA在引起PJI的早期促进生物膜产生粘附效果的信号分子种类。方法:实验第一部分:（1）微量肉汤稀释法测定庆大霉素、穿心莲内酯、高丝氨酸内酯酶对PA的抑菌能力。（2）庆大霉素、穿心莲内酯及高丝氨酸内酯酶连续24小时干预96孔板中培养的PA,每2小时取孔进行结晶紫实验,用酶标仪（BIOTCK ELX800）检测波长为570nm的吸光值,观察三种药物抑制PA产生生物膜的能力。（3）将钛合金薄片置入PA菌液,观察组加入高丝氨酸内酯酶溶液,对照组加入LB培养液,培养72小时,用环境扫描电子显微镜观察钛合金薄片上所附着的生物膜的形态,将观察组与对照组对比,观察PA产生的生物膜形态结构的差异。实验第二部分:（1）LC-MS/MS检测方案优化:用C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和3-Oxo-C12-HSL五种AHLs为样本,根据目标物母离子及子离子,寻找各自合适的去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）、入口电压（EP）和碰撞室出口电压（CXP）,获得LC-MS/MS检测以上五种AHLs的优化方案。（2）前处理方案回收率检测:将以上五种AHLs标准品分别与动物关节组织混合,用乙腈收集样本中的AHLs,再经固相萃取柱纯化、低温蒸干、复溶等前处理操作后,进行LC-MS/MS检测,计算五种AHLs的回收率。（3）体外培养及PJI动物模型组织中AHLs种类的定性:制作PA的体外培养及PJI动物模型,分别取培养液及PJI动物模型组织样本,用本部分实验（1）、（2）步骤的检测优化条件、前处理方案进行处理及LC-MS/MS检测,明确PA在体外培养及在PJI动物模型组织中的AHLs种类。实验第三部分:制作PA引起PJI的动物模型,观察组每天在关节腔中注射AHLs标准品溶液,对照组每天在关节腔中注射灭菌生理盐水,饲养7天,每组每天取一只实验动物标本,结晶紫实验法观察动物关节假体上粘附的生物膜含量,LC-MS/MS检测动物PJI关节组织中AHLs含量,环境扫描电子显微镜观察动物关节假体上附着的生物膜形态及结构。结果:1.庆大霉素的最低抑菌浓度为1ug/ml,穿心莲内酯及高丝氨酸内酯酶无明显抑制PA生长的作用。2.庆大霉素、穿心莲内酯、高丝氨酸内酯酶均可抑制PA产生生物膜,高丝氨酸内酯酶与庆大霉素抑制PA生物膜的能力更强、持续时间相对较长,穿心莲内酯稍弱且作用产生时间不一致。3.电子显微镜观察高丝氨酸内酯酶干预PA所产生的生物膜,仅有细菌松散地粘附,未能形成完整的生物膜,菌间只有少量的稀疏菌丝连接。4.LC-MS/MS检测C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和3-Oxo-C12-HSL的质谱参数如下:最优的去簇电压分别为60V、60V、70V、80V、80V;碰撞电压分别是:14V、14V、16V、15V、20V;定量离子对分别是（m/z）:200.1/101.9、228.2/101.7、256.1/101.9、284.0/101.9、298.3/101.9;5.本实验设计的前处理方案对动物组织中的C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和3-Oxo-C12-HSL检测回收率分别为:97.6%、90.2%、95.8%、124.1%、87.6%;6.LC-MS/MS对PA在体外培养及PJI动物模型组织进行检测发现,存在PA的样本中,均可检测到信号分子3-Oxo-C12-HSL的波峰,而C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL的波峰并不与PA的存在一一对应;7.用LC-MS/MS对PA引起PJI的动物模型样本进行检验,在感染发生的第四天可检测到明显的AHLs波形,浓度为2.129115ng/ml。8.对附着在PA引起的PJI假体的生物膜定量观察中,加入AHLs标准品的关节假体上生物膜量在感染初期的第3、4、5天均明显高于注射生理盐水的关节假体;9.PA引起的PJI假体上生物膜进行环境扫描电子显微镜观察发现,加入AHLs标准品的样本上可更明显、更早地出现丝状、片状及立体结构的生物膜。结论:1.LC-MS/MS检测PA引起的PJI关节组织上的AHLs的敏感性较高,信噪比大于10,且检测回收率大于80%,证明本实验所探索对PA引起的PJI关节组织的前处理方案及LC-MS/MS优化方案的一种可靠的检测方案;2.体外培养PA产生生物膜的粘附能力可以被QS信号分子的水解酶所抑制,其抑制效果较明显,且抑制时间较长,通过抑制信号分子降低关节假体周围感染治疗难度的方法,可能是未来治疗关节假体周围感染的一种新思路;3.在动物实验中,PA引起的PJI从第四天可以检测到AHLs分子的存在,且在注射AHLs标准品的PJI动物组中,关节假体上生物膜的量多于注射生理盐水的PJI动物组,并且前者的菌丝的连接、生物膜的结构更密集,说明AHLs的存在,有利于PA在PJI假体上形成或附着更多的生物膜,并可使生物膜发育得更成熟。