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目的:探讨外泌体源性TGF-β1抑制的microRNAs及其靶基因蛋白通路调控黑色素瘤及其微环境增殖、分化机制,为黑色素瘤提供新的治疗靶点。方法:(1)体内实验,采用蛋白印记法及实时定量PCR技术检测TGF-β1在黑色素瘤组织及黑色素痣组织中表达水平的差异。(2)体外实验,采用蛋白印记法及实时定量PCR技术检测TGF-β1在各种黑色素瘤细胞株及黑色素细胞株中表达水平的差异。(3)蛋白印记法检测正常黑色素细胞及恶性黑色素瘤细胞的外泌体中TGF-β1含量差异。(4)将从黑色素瘤细胞中提取的外泌体与人成纤维细胞WS1共培养。(5)采用实时定量PCR技术筛选出TGF-β1抑制最明显、最广泛的microRNA作为研究对象。(6)利用MTT法检测microRNA-411-5p对不同细胞株增殖与侵袭能力的影响。(7)采用免疫组织化学技术分析TGF-β1、microRNA-411-5p与临床病理各参数相关性。(8)运用生物信息学技术及网络资源预测miR-411-5p的靶基因并运用蛋白印记法及实时定量PCR技术对所预测的靶基因进行验证。(9)流式细胞仪检测转染MAP3K1siRNA MM细胞A375的细胞周期改变。(10)免疫荧光染色观察转染SP2siRNA的癌相关成纤维细胞CAF表型改变。结果:(1)与黑色素痣实质组织相比,黑色素瘤实质组织中TGF-β1表达量升高。与黑色素痣间质组织相比,黑色素瘤间质组织中TGF-β1表达量升高。(2)与人皮肤黑色素细胞株HEM-L相比,人恶性黑色素瘤细胞株A375中TGF-β1表达量升高。与人皮肤成纤维细胞株相比,癌相关成纤维细胞CAF中TGF-β1表达量升高。(3)与人皮肤黑色素细胞株HEM-L相比,人恶性黑色素瘤细胞株A375分泌的外泌体中TGF-β1表达量升高。(4)当黑色素瘤细胞中提取的外泌体与人成纤维细胞WS1共培养后,正常成纤维细胞转化为癌相关成纤维细胞。(5)利用Real-time PCR技术进行筛选得出microRNA-411-5p为TGF-β1抑制最明显、最广泛的microRNA。(6)microRNA-411-5p再表达可以使黑色素瘤细胞A375增殖能力及侵袭能力降低,同时可以使癌相关成纤维细胞CAF侵袭能力降低。(7)采用免疫组织化学技术分析TGF-β1与microRNA-411-5p呈负相关,其表达水平与病理分级、浸润深度及有无淋巴结转移有关(8)miR-411-5p-mimics转染后,结果显示靶基因SP2和MAP3K1在A375细胞中明显降低,而靶基因SP2在CAF细胞也中明显降低。(9)向黑色素瘤细胞A375转染MAP3K1siRNA可导致细胞周期发生G1期阻滞。(10)转染SP2siRNA的癌相关成纤维细胞CAF中Vimentin蛋白表达下降。结论:1.黑色素瘤细胞可以分泌含有大量TGF-β1的外泌体。2.miR-411-5p受到TGF-β1的负性调控。3.外泌体源性的TGF-β1可以通过自分泌方式经过TGF-β1-miR-411-5p-MAP3K1途径作用于肿瘤细胞本身,激活细胞周期导致促进细胞增殖能力。4.外泌体源性的TGF-β1可以通过旁分泌方式经过TGF-β1-miR-411-5p-SP2途径作用使邻近成纤维细胞转化为癌相关成纤维细胞,以参与构成肿瘤微环境。