枳壳始记载于《神农本草经》,为中医常用理气药。枳壳性微寒,味苦、辛、酸,具有理气宽中、行滞消胀之功效,主治胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、脏器下垂等症。虽然枳壳是中医临床常用药,但其性味及相关理论,文献记载出入较大,仍存在很多疑惑。本文基于中药“一药X味Y性(Y≤X)”的中药性味新假说理论,以枳壳为研究对象,运用中药性味可拆分,可组合的研究方法,综合运用中药学、药理学、化学等理论和技术,对枳壳的性味物质基础和性味药理学进行了研究,力求阐明其性味科学内涵,明晰其作用特点与适应症,为临床遣药组方奠定理论基础。同时也以更多的研究实例验证“中药一味一性、一药X味Y性(Y≤X)”的中药性味理论假说的客观性,进一步完善中药性味可拆分性、可组合性研究的规范,进而丰富中医药性味理论,并为临床用药及新药研发提供重要的参考。本文主要研究内容如下:1文献综述(1)本部分在系统查阅历代本草有关中药性味记载的基础上,通过对枳壳古今文献的整理与分析,介绍了枳壳品种及道地沿革考证、化学成分、药理作用和临床应用的研究现状,从而为本文研究的开展奠定了扎实的文献资料基础。(2)本文通过大量的文献查阅,对植物多糖的提取、分离、纯化、结构鉴定及生物活性进行了归纳和总结。为枳壳中多糖类大分子化合物的研究提供参考。(3)枳壳的性味有着相当复杂的演变历程,通过检索大量古籍文献与现代临床资料,系统梳理了枳壳性味理论的演变过程,确认不同时期、不同医家对性味理论的认识,深化对枳壳性味的理解。枳壳性味变化主要历经:由始载于《神农本草经》的“苦、寒”到唐、宋代的“苦,酸、微寒”和“苦,辛、微寒”,再到现、当代记载的“苦,辛,酸、微温”,经历了由“单味”到“复合药味”及药性“由寒到微温”的巨大发展演变过程。2枳壳性味物质基础的可拆分性研究中药的性味不仅表明了中药所具有的功能,也表明了其相应的物质基础。现代药理学研究结果提示,一类化合物或结构骨架类似的一类化学成分可能具有共同的药理作用。因此,本文综合考虑中药药效物质基础的种类、成分类别及成分的理化性质等因素,将枳壳水煎液拆分成4个组分,即多糖组分、黄酮组分、挥发油组分和生物碱组分。在获得各化学拆分组分基础上,采用UPLC-MS和GC-MS两种方法开展化学拆分组分的一般化学特征研究。研究结果表明:本文研究工作中建立的拆分方法,可达到组分之间拆分明确,化学成分互不交叉,具有科学性和规范性,可以为开展同类研究提供借鉴。3枳壳性味药理学评价体系的建立和各化学拆分组分的性味归属(1)本部分研究以“性味是对中药功效的高度概括与凝练”为切入点,采用传统的中医思维方式和现代药理学理论相结合的方法,建立性味—功效—药理指标的相关性,进而构建枳壳的性味药理学评价体系。本文采用与枳壳性味功效相关的促进胃排空,抗胃溃疡作用,镇痛、平喘化痰、利胆和健脾等复合药理学指标作为性味功效评价体系,对全部化学拆分组分的生物学效应开展研究。结果表明:促进胃排空作用的物质基础为挥发油组分和生物碱组分;抗胃溃疡作用的物质基础为黄酮组分和多糖组分;镇痛作用的物质基础为挥发油组分和生物碱组分;平喘化痰作用的物质基础为挥发油组分和生物碱组分;利胆作用的物质基础为黄酮组分;健脾作用的物质基础为多糖组分。(2)通过上述的实验研究结果,结合传统中医药理论、中医临床用药经验及现代药理学理论,对枳壳各化学拆分组分进行性味归属。实验结果如下:挥发油组分和生物碱组分为“味辛”的物质基础,黄酮为“味酸”的物质基础,多糖组分为“味苦”的物质基础。4枳壳多糖的分级提取、结构鉴定及生物活性研究(1)枳壳多糖的分离纯化及其抗氧化作用研究本文研究发现,枳壳中多糖组分具有一定的“健脾”活性。经过文献查阅,目前对于枳壳中多糖类化合物的研究仍处于空白阶段。本文对枳壳多糖的提取、分离、纯化、结构鉴定以及其生物活性进行了深入研究①采用冷水、热水、1mol/LNaOH溶液对枳壳多糖进行分级提取,得到枳壳冷浸粗多糖(CALA)、热提粗多糖(CALB)和碱提粗多糖(CALC);采用体外抗氧化实验(DPPH自由基清除实验、羟自由基清除实验、超氧自由基清除实验和H2O2清除实验)和小鼠体内抗氧化实验评价了 3种枳壳粗多糖的抗氧化活性,结果表明CALB的抗氧化活性最强。②通过弱阴弱阳离子交换串联树脂、离子交换纤维素、离子交换琼脂糖凝胶、高分辨丙烯葡聚糖凝胶等离子交换和分子筛柱色谱对CALB进行分离和纯化,得到4种均多糖,即CALB-1、CALB-2、CALB-3和CALB-4。进一步的研究证明,这4种均多糖均为非淀粉类物质,不含还原性单糖、多肽和蛋白质等杂质。通过高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析等方法和紫外、红外、HPLC和GC-MS等仪器对4种均多糖进行了初步的结构鉴定。③采用PMP柱前衍生化法测定了 4种均多糖的单糖组成,结果如下:CALB-1由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖组成;CALB-2由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖组成;CALB-3由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖组成;CALB-4由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖组成。通过体外抗氧化实验证明,在4种均多糖中,CALB-3的抗氧化活性最强。本文研究表明,枳壳的药效物质基础不仅仅是人们一直认为的挥发油、生物碱和黄酮等,还包括多糖类成分。枳壳多糖的分离纯化及其抗氧化作用研究深化了对中药枳壳的认识,为枳壳多糖的进一步研究以及开发利用提供了科学依据。(2)基于MAPKs信号通路的枳壳多糖CALB-3诱导PBMCs中细胞因子表达的作用机制研究本文发现,枳壳多糖具有促进小鼠脾细胞增殖的作用。因此,本文继续选取人外周血单个核细胞(PBMCs)为研究对象,以均多糖CALB-3为研究药物,探讨CALB-3免疫调节活性的作用机制。实验结果表明:CALB-3可促进PBMCs细胞增殖及细胞上清液中NO和细胞因子的分泌。此外,采用 Western blot 技术检测,发现 CALB-3 还可上调 MAPKs(ERK,JNK,p38)的磷酸化水平,并促进p65的核转位,进而诱导细胞因子的分泌而发挥免疫调节作用。(3)枳壳粗多糖CALB对60Coγ-射线诱导小鼠的抗辐射作用的研究通过上述实验发现,枳壳粗多糖CALB既表现出抗氧化作用又呈现出一定的免疫调节作用。综合两方面的活性,本文首次尝试探讨枳壳粗多糖CALB对60Coγ-射线诱导小鼠的抗辐射作用。实验结果表明:CALB各剂量组均能显著提高辐射小鼠的存活率,并提高小鼠骨髓细胞中DNA含量及降低骨髓细胞微核数。此外,CALB还可以促进脾细胞增殖,提高辐射小鼠血清、脑和肝组织中SOD和GSH-Px水平,同时降低MDA含量。这些结果证明,CALB对辐射损伤具有一定程度的保护作用,可用于枳壳的进一步开发与利用。5基于NF-κB信号通路的红橘素对LPS诱导的神经小胶质细胞免疫抑制作用的机制研究本文以LPS诱导的小胶质细胞为体外模型,筛选了枳壳中7种黄酮类化合物抗神经炎症的活性,结果证明红橘素的活性为最强。继之以红橘素为研究对象,探讨了其抗神经性炎症可能的作用机制。实验结果表明:红橘素可以减少一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的分泌。同时,可抑制一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶(COX-2)的蛋白表达水平以及TNF-α,IL-1β,IL-6的mRNA表达水平。此外,运用Western blot技术检测,发现红橘素还能抑制LPS诱导的ERK1、JNK1和p38的磷酸化水平以及p65核转位。