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目的:
结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。相关数据报道,结直肠癌的发病率分别占男、女新发恶性肿瘤的7.3%和8.5%。目前,结直肠癌仍然是全球威胁人类健康的一个主要疾病。结直肠癌的发病机制与抑癌基因的缺失、失活,癌基因的激活,细胞凋亡的失调等多因素相关,是一个错综复杂的过程。其中细胞凋亡的失调是参与结直肠肿瘤发生机制中的一个重要因素。细胞凋亡是一个复杂的过程,大量凋亡相关蛋白参与其中。如ASC、Caspases蛋白家族。目前一些体外研究报道:NALP1蛋白在细胞凋亡过程中亦发挥了重要作用。
NALP1是NALPs蛋白家族中的一员,它共包含六个结构域,分别为PYD结构域、NACHT结构域、NAD结构域、LRRs结构域、FIIND结构域和CARD结构域,其中PYD结构域和CARD结构域又是死亡结构域超家族成员。目前研究报道,NALP1主要功能为调节细胞凋亡,参与炎症反应和自身免疫性疾病的发生过程。其中,细胞凋亡的失调不但常参与肿瘤的发病机制,并且与大部分肿瘤的发展过程相关。所以我们推测NALP1与肿瘤的发病机制有关。
本实验旨通过检测结直肠癌组织中NALP1protein表达水平及mRNA转录水平,了解NALP1在结直肠癌组织与正常组织中差异,探究NALP1在结直肠癌发病机制中的作用。
方法:
一、实验分组
1.33例结直肠癌组织为实验组(肿瘤组),33例结直肠正常组织为对照组(正常组),通过检测NALP1protein表达水平及mRNA转录水平,了解NALP1在结直肠癌组织与正常组织中表达差异。
2.33例结肠癌组织根据性别、淋巴结转移(有转移为Y;无转移为N)、肿瘤分期(UICCTNMⅠ、Ⅱ期为早期;UICCTNMⅢ、Ⅳ为进展期)及肿瘤生长部位(结肠;直肠)分组,了解结直肠癌组间NALPprotein表达水平及mRNA转录水平差异,探究NALP1与肿瘤临床特征的关系。
二、实验方法
所有标本均用生理盐水清洗去除血液,尽可能剪除多余的组织。
1.用qRT-PCR方法研究NALP1mRNA在结直肠癌组织中的转录水平,并探讨其转录水平与性别、淋巴结转移、肿瘤分期及肿瘤生长部位是否存在联系。
2.用Westernblot方法研究NALP1protein在结直肠癌组织中的表达水平,探讨其表达量与性别、淋巴结转移、肿瘤分期及肿瘤生长部位是否存在联系。
3.用免疫组化方法研究NALP1protein在结直肠癌组织细胞中的表达位置。
三、统计学处理
用GraphPad.Prism.v5.0软件进行数据分析,组间比较用t检验,P<0.05为有显著性差异。灰度测量用Gel-Pro32软件,NALP1protein相对表达量=目的条带灰度值/内参灰度值表示。NALP1mRNA相对表达量=2-△△Ct,AACt=[目的基因的平均Ct值(样本组)-管家基因的平均Ct值(样本组)]-[目的基因的平均Ct值(对照组)-管家基因的平均Ct值(对照组)]
结果:
1.qRT-PCR:与结直肠正常组织相比,NALP1mRNA在结直肠癌组织中转录水平下调。NALP1mRNA的转录水平在性别、淋巴结转移、肿瘤分期组间无显著性差异(P>0.05);NALP1mRNA的转录水平在肿瘤生长部位组间存在显著性差异(P<0.05),即结肠癌和直肠癌组织中NALP1mRNA的转录水平不同。
2.Western-blot:与结直肠正常组织相比,NALP1protein在结直肠癌组织中表达下调。NALP1protein的表达量在淋巴结转移、肿瘤分期和肿瘤生长部位组间无显著性差异(P>0.05);NALP1protein的表达量在性别组间存在显著性差异(P<0.05),即男性和女性患者结直肠癌组织中NALP1protein的表达水平不同。
3.免疫组化:结果显示NALP1蛋白呈棕黄色细颗粒定位于结直肠组织细胞的胞浆中。
结论:
1.NALP1protein定位于结直肠组织细胞的胞浆中。
2.NALP1在结直肠癌组织中下调,推测NALP1可能与结直肠癌的发生有关。