研究背景子宫颈癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,严重威胁着妇女健康和生命,目前,子宫颈癌发病率居高不下,且发病年龄趋于年轻化。高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)持续感染是子宫颈癌发生的最重要危险因素之一,寻找新的拮抗HR-HPV感染治疗子宫颈癌的方法迫在眉睫。以基因治疗为代表的生物治疗目前已成为继手术、化疗、放疗之后针对恶性肿瘤的第四种治疗模式,其中基因治疗是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞,使其表达此基因并获得特定的功能,继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用,从而达到治疗目的。目前,基因治疗已成为子宫颈癌治疗的新趋势,然而有效的基因治疗依赖于外源基因高效而稳定的表达,因此,选择合适、有效的靶基因成为目前针对子宫颈癌基因治疗的首要任务。p53是抑癌基因,定位于17p13.1,全长16~20kb,编码分子量为53kD由393个氨基酸组成的核内磷酸化蛋白,在子宫颈癌组织中表达降低,且以野生型为主。野生型p53主要具有调节细胞周期、抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡等功能。具体主要通过调节p21基因的表达阻滞细胞周期,调控NFκB-Bcl-2途径抑制细胞的生长,调节下游靶基因PUMA、NOXA、Perp来促进肿瘤细胞发生凋亡。子宫颈癌细胞中HR-HPV编码的E6蛋白通过抑制宿主细胞抑癌基因p53的功能,引起细胞癌变。因此,p53在子宫颈癌细胞中的表达降低或功能失活是子宫颈癌发病的重要因素之一。显然,提高p53的表达或者恢复p53的功能是子宫颈癌治疗的重要策略。GRIMs(genes associated with retinoid-IFN-inducedmortality)是最近发现的一群参与干扰素(interferon, IFN)和维甲酸(retinoic acid, RA)合并诱导的细胞凋亡基因,是Kalvakolanu用反义RNA敲除技术在乳腺癌细胞中筛选鉴定并首先报道的凋亡蛋白。Grim-19属GRIMs家族成员,是参与细胞线粒体的呼吸作用和调控细胞凋亡的新基因,定位于19 p13.2,该区的多种基因为前列腺癌的抑制基因。编码含144个氨基酸残基的蛋白质,分子量约16kD,表达于人体多种正常组织中,主要定位在线粒体,细胞核也有少量表达。研究发现GRIM-19的表达促进了细胞的凋亡,其表达降低或位点突变可以导致细胞的异常增殖和恶性转化。许多肿瘤中,如甲状腺肿瘤、肾癌、口腔癌、结直肠癌等中均发现GRIM-19表达的降低。STAT3在许多肿瘤中处于持续激活状态,是肿瘤治疗的新靶点。目前研究认为GRIM-19是STAT3表达和激活的负性调节子,GRIM-19与其结合后,抑制其激活引起的下游基因的转录。但是GRIM-19在子宫颈癌细胞发生、发展中所发挥的具体作用尚不清楚。本课题组率先对子宫颈癌细胞中GRIM-19的表达及功能进行了相关研究。研究发现,子宫颈癌组织中GRIM-19表达显著降低,建立稳定表达GRIM-19的HeLa细胞株,命名为HeLa/GRIM-19细胞,体内体外实验中均证实,GRIM-19具有抑制STAT3活性,阻滞细胞生长,促进细胞凋亡的重要作用。鉴于之前研究结果已确定子宫颈癌组织中GRIM-19表达降低,且GRIM-19具有抑制子宫颈癌细胞生长,促进其凋亡的作用;而p53蛋白在子宫颈癌的发病机制中具有重要抗肿瘤、促细胞凋亡作用。因此,我们探讨了子宫颈癌细胞中GRIM-19对p53基因表达的影响。发现,GRIM-19表达的恢复具有诱导p53蛋白积聚的作用,并且积聚的p53蛋白具有抑制子宫颈癌细胞增殖的功能。目的研究GRIM-19对p53基因表达的影响及分子机制,为子宫颈癌的治疗提供理论依据及治疗线索。方法⑴采用Western Blot方法检测瞬时转染pGRIM-19后子宫颈癌细胞株HeLa细胞中p53及下游靶基因p21、PUMA的蛋白表达;⑵使用siRNA沉默GRIM-19后,采用Western Blot方法检测子宫颈癌细胞株HeLa细胞中p53及下游靶基因p21、PUMA的蛋白表达;⑶采用Western Blot方法检测瞬时转染pGRIM-19后子宫颈癌细胞株SiHa、CaSki细胞中p53及下游靶基因PUMA的蛋白表达;⑷使用siRNA沉默GRIM-19后,采用Western Blot方法检测子宫颈癌细胞株SiHa、CaSki细胞中p53及下游靶基因PUMA的蛋白表达;⑸采用Western Blot方法检测瞬时转染pGRIM-19或GRIM-19 siRNA后卵巢癌细胞株HO8910细胞中p53蛋白的表达;⑹使用Thymidine同步化后,采用流式细胞仪检测稳定表达GRIM-19的HeLa细胞周期的变化;⑺采用FQ-PCR方法检测瞬时转染pGRIM-19后HeLa细胞中p53 mRNA的表达;⑻采用报告基因检测瞬时转染pGRIM-19后HeLa细胞中p53启动子的激活情况;⑼使用siRNA沉默STAT3后,采用Western Blot检测HeLa、SiHa细胞中p53蛋白的表达;⑽采用Western Blot检测瞬时转染STAT3C及STAT3DN后子宫颈癌细胞株HeLa、SiHa细胞中p53蛋白的表达;⑾使用CHX处理后采用Western Blot检测稳定表达GRIM-19的HeLa细胞中p53蛋白半衰期的变化。结果⑴Western Blot检测结果显示瞬时转染pGRIM-19后HeLa细胞中p53及下游靶基因p21、PUMA的蛋白表达较对照组明显升高,差异有统计学意义,p<0.05;⑵Western Blot检测结果显示通过siRNA沉默GRIM-19后HeLa细胞中p53及下游靶基因p21、PUMA的蛋白表达较对照组明显下降,差异有统计学意义,p<0.05;⑶Western Blot检测结果显示瞬时转染pGRIM-19后SiHa、CaSki细胞中p53及下游靶基因PUMA的蛋白表达较对照组明显升高;⑷Western Blot检测结果显示通过siRNA沉默GRIM-19后SiHa、CaSki细胞中p53及下游靶基因PUMA的蛋白表达较对照组明显下降;⑸Western Blot检测结果显示瞬时转染pGRIM-19或GRIM-19 siRNA后HO8910细胞中p53蛋白的表达较对照组均无明显变化;⑹流式细胞仪检测结果显示稳定表达GRIM-19的HeLa细胞周期较对照组细胞明显阻滞于G1期;⑺FQ-PCR检测结果显示瞬时转染pGRIM-19后p53 mRNA表达水平较对照组则无明显变化,差异无统计学意义,p>0.05;⑻报告基因检测结果显示瞬时转染pGRIM-19后p53的启动子较对照组无明显激活,差异无统计学意义,p>0.05;⑼Western Blot检测结果显示通过siRNA沉默STAT3后HeLa、SiHa细胞中p53蛋白表达较对照组无明显变化;⑽Western Blot检测结果显示瞬时转染STAT3C及STAT3DN后HeLa、SiHa细胞中p53蛋白表达较对照组无明显变化;⑾CHX处理后Western Blot检测结果显示稳定表达GRIM-19的HeLa细胞中p53蛋白的半衰期较对照组细胞显著延长,差异有统计学意义,p<0.05。结论GRIM-19具有诱导HR-HPV感染的子宫颈癌细胞中p53蛋白积聚的作用,且积聚的p53蛋白具有抑制子宫颈癌细胞增殖的功能;该调控作用既不是直接作用,也不是通过抑制STAT3间接抑制p53基因的转录和翻译,而是通过抑制p53蛋白的降解,延长了p53蛋白的半衰期。