研究背景干细胞是指在一定条件下具有无限制自我更新和增殖分化能力的一类细胞。按其存在的不同时期可分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞是存在于各种已分化组织中的未分化细胞。目前已经在多种组织中发现成体干细胞的存在,如神经干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞等。子宫内膜是一个高度活跃的组织,具有很强的自我更新及修复能力,月经、分娩、绝经后激素补充治疗等都能从内膜基底层再生出腺体和基质,形成新的功能层。早在1978年Prianishnikov因子宫内膜具有周期性增殖、分化和脱落的特点而提出存在子宫内膜干细胞的可能,又指出干细胞可能存在于子宫内膜基底层,即在子宫肌层与内膜交界区,从而使功能层内膜增生修复,始而往复。随后有作者在临床实践中又发现,在为功能失调性子宫出血的妇女电切大部分子宫内膜后,内膜还可部分再生,并有妊娠的报道,证明了存在干细胞再生子宫内膜的可能。子宫内膜干细胞是一群具有无限增殖能力的细胞,通过单克隆细胞培养可以从功能上鉴定。单克隆细胞培养主要有软琼脂培养法、有限稀释法、单细胞显微操作法和流式细胞仪分离法等多种方法,其中有限稀释法最常用。其原理是将细胞悬液连续倍数稀释至极低密度,然后接种于培养板上,培养一段时间后可能出现单个细胞克隆。它与软琼脂培养法、单细胞显微操作法和流式细胞仪分离法等方法比较,具有操作简单,周期较短和费用较低的优点。子宫内膜干细胞为分化未成熟的细胞,不能仅从形态学上将子宫内膜干细胞与其他子宫内膜细胞加以区别,一般多从功能上界定。当然,最好的方法是利用特异识别的组织学和免疫学标志物进行判定干细胞。目前尚未发现其特异性标志物,但有较多文献报道可能的候选标志物有：CD90、CD29、CD73,可能不表达的标志物有：CD133、CD34、CD45。乙醛脱氢酶(ALDH)是细胞内的一组同工酶,在干细胞分化早期使视黄醇氧化成视黄酸,ALDH1是ALDH家族的主要成员。ALDEFLUOR检测试剂盒提供的不带电荷的ALDH底物(BAAA)能够通过扩散进入活细胞。被细胞内的ALDH转化为带负电荷的反应产物(BAA-)。该产物滞留在具有完整细胞膜的细胞中,使ALDH高表达的细胞呈现明亮的荧光(ALDHhigh),可以通过流式细胞仪的绿色通道检出。在乳腺组织的正常细胞或癌细胞中,ALDEFLOUR阳性细胞具有类似干细胞的自我更新和多向分化能力,而阴性细胞则无此功能。在造血细胞、胰腺癌和肺癌等多种组织中ALDH1高表达,故ALDH1有望成为分离和鉴别多种干细胞的共同标志。干细胞分化的机理和诱导条件迄今为止还不清楚,大多数人认为干细胞的分化与其所处的微环境“壁龛”密切相关,不同的组织细胞微环境有着不同的细胞因子,可能是诱导干细胞获得靶组织的表型,并向不同细胞谱系分化的主要原因之一。已有研究证实,视网膜细胞培养上清液可以诱导骨髓间充质干细胞向神经元、胶质细胞与视细胞分化。还有研究采用毛囊培养上清液模拟体内的微环境,发现骨髓间充质干细胞具有向毛囊干细胞分化的潜能。因子宫内膜干细胞本身的生物学特性以及方便的取材,使它在组织替代治疗等方面具有广泛的临床应用前景。有试验发现子宫内膜干细胞促进血管生成治疗烧伤,另有科学家在帕金森模型的小鼠体内注入子宫内膜干细胞可以生成多巴胺治疗帕金森病。子宫内膜是胚胎发育的温床,子宫内膜过薄可阻碍受精卵在子宫内膜着床和发育,子宫内膜创伤或感染是导致妇女宫腔粘连和不孕的常见原因之一,其治疗策略最重要的一点是促进子宫内膜再生和功能恢复,而对于重度或广泛的内膜损伤,目前的治疗方法尚难以解决子宫内膜重新再生问题。另外,子宫内膜干细胞的数量、功能、调控和定位机制的改变也可以引发各种子宫内膜疾病,近年来干细胞应用于临床治疗的研究越来越多。通过对子宫内膜干细胞的研究,可进一步了解、认识子宫内膜的发生、增殖和演变规律,为子宫内膜增殖异常的疾病、子宫内膜的损伤、受孕和胚胎植入、绝经后的激素补充治疗以及肿瘤等多种疾病的预防和治疗,提供了一种新的理念和重要的指导意义。本课题拟于体外分离、培养、鉴定子宫内膜干细胞,并对其进行诱导分化,以证实子宫内膜干细胞的存在性,寻找子宫内膜干细胞可能的标记物,同时探索诱导分化为子宫内膜细胞的方法。方法1.取包括5mm子宫肌层的子宫内膜全层为样本,采用机械和酶消化相结合的方法分离出人子宫内膜细胞,用200目和400目的滤网两次过滤后,分离出基质细胞和上皮细胞,用波形蛋白和角蛋白免疫荧光染色鉴定基质细胞和上皮细胞。2.部分样本的基质细胞和上皮细胞经有限稀释法培养,调整细胞悬液的细胞密度至300个基质细胞/cm2和500个上皮细胞/cm2。培养15d,对细胞的形态及生长特性进行观察；采用流式细胞仪对细胞进行抗原CD133、CD34、CD45、 CD90、CD73及CD29的表型鉴定。3.另一部分样本的基质和上皮细胞用ALDEFLUOR检测试剂盒标记细胞并经流式细胞仪分选。根据ALDH活性的强弱,分选出ALDHhigh细胞和ALDHlow细胞,用有限稀释法培养细胞,调整细胞悬液的细胞密度至300个基质细胞/cm2和500个上皮细胞/cm2。对细胞的形态及生长特性进行观察；采用流式细胞仪对细胞进行抗原c-kit、CD90、CD73及CD29的表型鉴定。4.培养基质和上皮细胞,每天收集上清液作为条件培养液备用。在步骤2培养的子宫内膜干细胞中选取长势良好的细胞,一部分用无菌的条件培养液诱导,即为实验组。另一部分子宫内膜干细胞用DMEM培养液培养,即为对照组。倒置显微镜下观察细胞的形态学变化,用流式细胞仪检测诱导后细胞CD13、CD9的表达。结果1.子宫内膜干细胞原代培养、观察及鉴定(1)镜下见刚贴壁的上皮细胞呈多角形或椭圆形,基质细胞呈梭形。(2)在培养上皮细胞的第5d左右,发现大约5～10个细胞形成巢状结构,培养到8～9d时大多数细胞凋亡,巢状结构消失,上皮细胞未发现克隆形成。(3)基质细胞在培养的第3～4d开始增殖,在第15d中止培养时,可见有含松散排列细胞组成的小克隆存在,也有排列紧密小细胞的较大克隆出现。未经ALDH分选的基质细胞克隆形成率达1.34%±0.44%,大克隆和小克隆的形成率分别为0.02%±0.06%和1.32%±0.44%。细胞呈纤维样,排列呈辐射状。(4)流式细胞检测子宫内膜干细胞表现出CD29、CD90、CD73阳性,CD34、 CD45、CD133阴性。2.乙醛脱氢酶活性检测子宫内膜干细胞(1)经过ALDH分选发现基质细胞中ALDHhigh细胞占1.88%±0.17%,上皮细胞中未发现ALDHhigh细胞。(2)经过15d的原代培养,ALDHhigh基质细胞的克隆形成较多,克隆形成率4.50%±0.82%, ALDHlow细胞的克隆形成率为1.06%±0.34%(P<0.001)。ALDHhigh细胞和ALDHlow细胞中大克隆的形成率分别为0.11%±0.12%和0.04%±0.08%(P<0.001)。ALDHhigh和ALDHlow细胞中小克隆的形成率分别为4.40%±0.81%和1.02%±0.30%(P<0.001)(3)流式细胞检测子宫内膜干细胞表现出c-kit、CD29、CD90、CD73阳性。3.子宫内膜干细胞在条件培养液诱导后的培养、观察及鉴定(1)对照组子宫内膜干细胞呈梭形,外形轮廓不清楚,胞浆丰富透明,呈现中间稍宽,两端尖的形态,排列紧密,呈放射状。(2)实验组子宫内膜干细胞可见少数细胞发生形态改变,部分细胞呈团状排列生长,呈多角形的上皮细胞改变,部分细胞分散生长,呈较扁平、纺锤体状的基质细胞改变。(3)实验组子宫内膜干细胞的CD13表达率为8.37%±0.51%,对照组的CD13表达率为1.88%±0.22%(P<0.001)。同时实验组子宫内膜干细胞的CD9表达率为9.24%<0.90%,对照组的CD9表达率为1.68%±0.25%(P<0.001)。讨论近年有研究表明子宫内膜存在具有高度增殖、自我更新和分化潜能的干细胞,本实验结果证实子宫内膜中存在干细胞,实验在基质细胞中发现了两种不同大小的克隆,Chan RW等的研究认为大克隆是由子宫内膜前体细胞或干细胞起源的,而小克隆起源于子宫内膜前体细胞分化而来的子代暂时增殖细胞(transit amplifying, TA), TA细胞增殖能力较干细胞较弱,并最终仅分化为具有不同功能、没有增殖能力的终末细胞。本实验培养的子宫内膜干细胞经流式鉴定骨髓间充质干细胞标志物CD29、CD90、CD73阳性,上皮干细胞因子CD133阴性,而造血细胞的表面标志物如造血前体细胞标志抗原CD34和CD45的表达均呈阴性,子宫内膜干细胞的表面标记物与骨髓间充质干细胞表面标记物大体一致,提示可能来源于间充质干细胞。ALDH1可能在干细胞的早期分化中起重要作用,在多种组织类型的肿瘤干细胞中呈高表达,而高表达ALDH1的细胞具有干细胞的特性。目前,研究证实子宫内膜中存在干细胞,但子宫内膜干细胞所占子宫内膜总细胞比例很低,且缺乏特异性的标记物。本实验在子宫内膜干细胞中发现乙醛脱氢酶活性高的细胞,且具有更高的集落形成能力,为将来有效富集子宫内膜干细胞提供方法。发现子宫内膜干细胞表达c-kit阳性,c-kit是原癌基因,又叫干细胞因子受体,可编码一种穿膜酪氨酸激酶受体分子。存在于造血干细胞膜上,它的配体分子是造血干细胞因子,表达此表面抗原可以作为鉴定子宫内膜干细胞样细胞的一个标记物。本实验利用子宫内膜细胞培养上清液诱导子宫内膜干细胞分化为子宫内膜基质样和上皮样的细胞,使得合成具有完整解剖结构和良好功能的子宫内膜成为可能。初步证明了在体外的诱导条件下,子宫内膜干细胞具有向子宫内膜细胞分化的巨大潜能。随着对子宫内膜干细胞研究的深入,诱导内膜干细胞向内膜细胞分化,治疗内膜损伤,为子宫内膜过薄和有宫腔粘连的妇女进行内膜修复将成为可能。迄今为止,国内外学者对宫腔粘连的发病机制进行了大量研究,一致认为子宫内膜修复障碍可能是宫腔粘连形成的主要机制,在病理情况下,如流产后刮宫或其它宫腔操作后,子宫内膜修复障碍,结果瘢痕形成,粘连发生。子宫内膜干细胞减少或缺失可能与子宫内膜修复障碍、宫腔粘连发病机制密切相关,本实验通过子宫内膜干细胞体外向子宫内膜细胞分化,从干细胞层面探讨宫腔粘连移植治疗的可行性,这项研究将对探寻新的宫腔粘连治疗方案、提高宫腔粘连治愈率及妊娠率具有重要意义。但是,诱导子宫内膜干细胞后进一步分化为子宫内膜的可能性,需进一步做严格的动物实验,进行深入细致的探究,目前,我们的研究团队正在做干细胞治疗宫腔粘连的动物实验,另外,子宫内膜干细胞向子宫内膜细胞分化的分子机制以及分化后细胞的功能有待于进一步研究。结论1.实验证明在人子宫内膜中存在少量具有克隆形成能力和高度增生潜能的干细胞,这些干细胞可能来源于骨髓间充质干细胞。2.乙醛脱氢酶活性高的细胞具有更强的集落形成能力,并表达部分干细胞表面标志。3.子宫内膜混合细胞培养上清液对子宫内膜干细胞具有定向诱导分化作用,但诱导不完全,具体机制仍需深入研究。