论文部分内容阅读
骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)起源于中胚层,主要存在于哺乳动物的骨髓中,与造血干细胞(Hemopoietic stem cells,HSCs)共存。BMSCs不仅参与构建造血微环境,发挥支持造血的作用,而且易于体外分离培养和扩增、可自体移植并具有跨胚层分化为多种细胞类型的能力,未分化的或经遗传修饰过的BMSCs有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的理想种子细胞。
本研究目的在于阐明兔BMSCs的生物学特性,优化兔BMSCs的增殖培养条件,并研究其分化为脂肪细胞的潜能,以便未来利用该类细胞作为疾病细胞和基因治疗的模型。为此,本试验利用一月龄日本大白兔为对象,较为系统全面地研究了其BMSCs的分离、培养、扩增、鉴定、形态学、生长特性及体外诱导分化能力,为进一步深入研究BMSCs的诱导分化和应用打下实验基础。
1.本试验应用红细胞裂解液法,根据骨髓间充质干细胞在培养瓶中贴壁生长的特点,成功分离得到兔股骨和胫骨MSCs,体外培养至第7代。本试验所分离的兔BMSCs,增殖能力强,体外适应性较好,通过绘制细胞生长曲线、测定24h贴壁率得出,随着传代次数的增多,增殖能力下降,贴壁时间延长,选用前4代传代细胞作为进一步的研究对象最为合适；经免疫组化实验得出兔BMSCs表面标志CD90、CD44阳性表达,CD34阴性,可初步鉴定所分离的细胞为兔BMSCs,为进一步的实验奠定基础。
2.本试验通过四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)比较不同培养基及血清浓度对兔BMSCs生K的影响,结果发现不加血清时,细胞在LG—DMEM和DMEM/F12中的生长速度没有显并差异(P>0.05),加血清后,细胞在DMEM/F12中的生长速度均比在LG—DMEM中的生长速度快(P<0.05),其中兔骨髓间充质干细胞在DMEM/F12+20％FBS培养基中生长速度最快。另外,在LG—DMEM+10％FBS培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),通过MTT法来检测bFGF对体外培养的兔骨髓MSCs增殖的影响,结果表明,bFGF具有促进体外培养的兔BMSCs增殖的作用,其促增殖效应与其质量浓度关系密切:5～20μg/L效应不明显(P>0.05),在40～100μ g/L时促增殖效应显并(P<0.05),在80μ g/L时其促增殖效应最强(P<0.01)。通过检测细胞周期分析bFGF促进兔BMSCs增殖的机理,结果表明,添加bFGF组的细胞中处于S+G2/M期(增殖指数)的细胞百分率为(32.83±1.47)％,与对照组(17.19±1.38)％相比明显增加(P<0.01)。
3.联合应用地塞米松、胰岛素体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞分化,诱导7d后细胞内有脂滴,随着时间延长,脂滴逐渐增加并融合为脂泡,细胞体积逐渐增大由原来的长梭形变为椭圆形或多角形,胞核被挤向一侧,油红O染色呈阳性,从而建立了MSCs分化为脂肪细胞的模型,有助于研究肥胖发生的机制。同时,这也是和骨髓造血干细胞的区别之一。