基于Akt信号通路的食管鳞癌放疗增敏相关长链非编码RNAs筛选及其潜在生物学功能和分子机制初探

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第一部分:Akt抑制剂在食管鳞癌中放疗增敏生物学表型的研究目的:通过体内和体外实验观察曲西立滨磷酸酯(Triciribine,triciribine)对蛋白激酶B(Protein Kinase B,Akt)及其下游靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和缺氧诱导因子-1即低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)的表达变化,探讨曲西立滨磷酸酯对食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)放射敏感性的影响,探讨曲西立滨磷酸酯在食管鳞癌中增加放疗敏感性的机制。方法:选择两种食管鳞癌细胞株ECA109、KYSE450,在不同浓度梯度、乏氧状态和时间点条件下,选取Akt抑制剂曲西立滨磷酸酯处理食管鳞癌细胞,采用细胞增殖-毒性检测法(Cell Counting Kit-8,CCK8)观察曲西立滨磷酸酯对不同食管鳞癌细胞的作用;使用蛋白质免疫印迹法(Western-blot)验证不同浓度曲西立滨磷酸酯处理后细胞Akt、p-Akt、HIF-1α和VEGF蛋白表达量的改变;分别给予常氧、乏氧、乏氧联合曲西立滨磷酸酯及和顺铂阳性对照组6MV-X线辐照处理后,通过克隆形成实验观察曲西立滨磷酸酯对乏氧和未乏氧食管鳞癌放射敏感性的影响;使用流式细胞仪检测不同处理组内的细胞凋亡率;构建无胸腺裸鼠(Nude Mouse,简称裸鼠)食管鳞癌移植瘤模型(ECA109),实验分为四组,分别是对照组、单纯辐照组、腹腔注射曲西立滨磷酸酯组、腹腔注射曲西立滨磷酸酯联合辐照组。辐照组皮下移植瘤单次辐照剂量8Gy,辐照14天后处死裸鼠,测量肿瘤体积,蛋白质免疫印迹法检测肿瘤内Akt、p-Akt、HIF-1α和VEGF表达情况。结果:曲西立滨磷酸酯抑制食管鳞癌细胞ECA109和KYSE450的增殖,具有时间和剂量依赖性;通过分析拟合曲线我们发现曲西立滨磷酸酯处理乏氧食管鳞癌细胞24小时后,与单纯辐照组相比,乏氧食管鳞癌细胞的辐射损伤更明显,曲西立滨磷酸酯作用后,乏氧细胞辐照组细胞的凋亡率明显升高,并且存在曲西立滨磷酸酯剂量依赖性;曲西立滨磷酸酯作用于乏氧食管癌细胞时,p-Akt、乏氧相关蛋白HIF-1α和血管内皮因子VEGF的蛋白表达量下降,且存在呈剂量效应相关。更进一步研究发现,曲西立滨磷酸酯明显降低放疗后裸鼠ECA109细胞移植瘤的增殖速度,同时通过Western Blot检测发现裸鼠移植瘤模型中曲西立滨磷酸酯可降低移植瘤内p-Akt、HIF-1α、VEGF蛋白表达量。结论:在食管鳞癌中,Akt小分子抑制剂曲西立滨磷酸酯处理后可降低食管鳞癌细胞p-Akt、HIF-1α和VEGF蛋白的表达量,并能增加乏氧状态下不同食管鳞癌细胞的放疗敏感性。体内实验证实,曲西立滨磷酸酯配合放疗影响裸鼠移植瘤的增殖。第二部分:Akt调控的食管鳞癌放疗增敏相关Lnc RNAs的筛选及分子生物学机制初探目的:本课题拟通过食管鳞癌临床标本、细胞系及裸鼠动物模型,筛选Akt调控的食管鳞癌放疗增敏相关Lnc RNAs。进一步通过研究筛选出的LINC00293生物学表型及其和转录因子ETS1(E-twenty-six-1)结合,进而上调重要的抗凋亡基因MCL1(BCL2 family apoptosis regulator)影响放疗敏感性的机制,探索Akt小分子抑制剂曲西立滨磷酸酯发挥放疗增敏作用的分子生物学机制。方法:收集局部晚期食管鳞癌患者肿瘤组织共计60例,并随访一年。以完成根治性放化疗患者一年的病情评估为标准,将其分为两组。放疗后肿瘤无变化或半年内进展为放疗抵抗组(n=30),放疗后肿瘤缩小及一年内病情稳定为对照组(n=30)。通过Akt小分子抑制剂曲西立滨磷酸酯作用后,筛选出依赖Akt的Lnc RNAs,结合TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库分析Lnc RNAs基因表达量相关生存差异,选择LINC00293作为后续研究重点。采用RNA pull down实验结合质谱分析(mass spectrometry,MS)筛选直接结合LINC00293的下游靶基因,转录因子ETS1在MS中分值最高,且RIP结合Western Blot实验验证ETS1信号最强。继续通过q PCR检测LINC00293和转录因子ETS1的m RNA表达量,同时通过免疫组化检测转录因子ETS1及下游相关凋亡通路蛋白表达量;分析上述基因表达量变化与预后的相关性。选取食管鳞癌常见细胞株,通过q PCR及Western Blot检测不同细胞株中LINC00293和ETS1在RNA和蛋白水平表达量的变化。选择表达量相对较高的细胞株用于后续敲低LINC00293和ETS1实验(ECA109、KYSE450)。构建LINC00293和ETS1敲降的慢病毒载体,建立稳转的食管鳞癌细胞株。将实验组分为空载体组、sh阴性对照组、LINC00293敲低组、ETS1敲低组和LINC00293+ETS1双敲低组。通过克隆形成实验及细胞增殖实验(Cell Counting Kit-8,CCK-8)测增殖,选取流式细胞仪测凋亡,采用免疫荧光测DNA双链损伤指标γ-H2AX,通过比较放疗前后不同实验组间的变化,明确敲降LINC00293和ETS1对放疗抵抗的影响。进一步利用Northen Blot和Protein Atlas数据库明确食管鳞癌细胞株中LINC00293和ETS1的亚细胞定位是否在细胞核。在成功构建敲降的LINC00293和ETS1稳转食管鳞癌细胞株基础上,构建BALB∕c裸鼠皮下荷瘤模型。肿瘤直径达5cm后分别予以6MVX线放疗,2Gy/次,1次/天,共照射5天,总剂量达到10Gy。以实验用裸鼠死亡为记录终点,记录放疗前后各组瘤体的改变。取肿瘤组织固定,并制作裸鼠模型生存曲线,比较各组间生存差异。针对裸鼠肿瘤组织行Northen Blot、q PCR及western blot检测LINC00293和ETS1的亚细胞定位、表达变化和凋亡相关蛋白表达的变化。在体评价LINC00293对食管癌细胞放疗敏感性及对ETS1表达的影响。通过RIP及拯救实验明确LINC00293与ETS1直接结合并参与放疗抵抗。在LINC00293敲低的稳转细胞株中,检测ETS1在蛋白和m RNA水平表达量的变化。同时在ETS1敲低的稳转细胞株中,检测LINC00293的m RNA表达量变化。验证二者通过直接结合形成正反馈回路的关系。结果:放疗后肿瘤无变化或半年内进展为放疗抵抗组,放疗后肿瘤缩小及一年内病情稳定为对照组,行lnc RNA测序筛选二者间的差异。GO(Gene Ontology)富集分析,明确137个组间差异倍数≥5的lnc RNAs的主要生物学功能及涉及的通路,靶基因主要生物学功能为凋亡、DNA损伤、有丝分裂及DNA代谢。Graphpad Prism 7绘制放疗后食管鳞癌患者lnc RNAs生存曲线,我们发现ENSG00000253314即LINC00293基因表达的变化影响放疗后食管癌病人的生存期,且其表达量越高,患者生存期越短。敲降LINC00293的ECA109细胞,增殖受到抑制,DNA损伤增加。RNA pull down结合MS筛选直接结合LINC00293的下游靶基因。转录因子ETS1在MS中分值最高,且RIP结合Western Blot实验验证ETS1信号最强。利用瞬时转染技术,在食管鳞癌细胞中敲降LINC00293,ETS1在m RNA及蛋白水平均下降;当敲降ETS1时,LINC00293的m RNA水平也随之降低。提示二者间存在正反馈回路。Northern Blot提示LINC00293的亚细胞定位在细胞核,The human protein atlas数据库显示ETS1亚细胞定位也为细胞核。敲降LINC00293或ETS1,MCL1的蛋白表达水平降低;但敲降MCL1后,LINC00293或ETS1的m RNA和蛋白表达量无变化。PROMO数据库选择容错率为0,显示ETS1可能结合在LINC00293的启动子区域。结论:食管鳞癌中Akt调控的LINC00293上调参与促进放疗抵抗,并影响食管鳞癌患者预后,是通过与ETS1形成正反馈回路促进MCL1表达导致放疗抵抗。揭示Akt小分子抑制剂曲西立滨磷酸酯作用后食管鳞癌放疗敏感性增加的机制。
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