金黄色葡萄球菌是一种兼性胞内菌,能在寄主细胞内存活及繁殖(包括吞噬细胞及非吞噬细胞),包括可以存在于亚细胞器或胞液中,从而引起持续或周期性感染。然而,在已知的抗生素中,有超过三分之二的抗生素对胞内菌感染是没有效果的。甚至研究发现临床上常用于治疗MRSA的万古霉素、利奈唑胺和达托霉素对胞内MRSA也无抑制作用。抗生素在细胞内浓度低,常常处于亚抑制浓度(对胞内细菌而言),这不仅导致它们对细胞内病原体的效力急剧下降,而且还促进抗生素耐药。因此,治疗胞内菌感染仍然面临着巨大的挑战,为了治疗细胞内感染性疾病,人们对提高抗生素进入细胞的能力有着极大的兴趣。外泌体以其天然的物质转运特性和优良的生物相容性,可递送化学药物、蛋白质和基因药物等多种药物,在药物载体领域具有巨大的潜力。基于此,本论文拟用生物相容性好的外泌体作为药物载体,制备含抗菌药物的外泌体,用于治疗胞内MRSA感染。主要研究内容如下:(1)小鼠巨噬细胞来源的外泌体制备采用聚合物沉淀法从小鼠巨噬细胞上清液中分离获得了大量外泌体。透射电子显微镜观察表明:外泌体膜结构完整,大多呈圆形或杯形且大小各异,直径范围约为30-100 nm。经动态光散射法测定统计,颗粒平均粒径为70.42±1.52 nm,Zeta电位为-7.18±0.51 mV。Western blot检测发现,颗粒富含外泌体特异性蛋白CD63和Flotillin 1。通过对细胞上清液浓缩再用试剂盒提取,获得的外泌体含量高,结构完整,为下游载药奠定了较好的基础。(2)外泌体负载利奈唑胺治疗胞内MRSA的研究将小鼠巨噬细胞来源的外泌体与利奈唑胺共孵育,制备了负载利奈唑胺的外泌体。透射电子显微镜观察表明负载抗生素后,外泌体的形貌并没有被改变,动态光散射法测试也获得了相似的结果。外泌体在酸性和中性介质中均可有效释放药物,并且载药后并不影响外泌体进入细胞,同时对巨噬细胞无明显的毒性,这表明外泌体具有良好的生物相容性,是一种理想的药物载体。进一步地,我们构建了小鼠巨噬细胞内MRSA感染模型和小鼠腹腔感染模型,采用平板菌落计数法和激光共聚焦显微镜全面评估利奈唑胺外泌体纳米材料对胞内MRSA的抑制情况。实验结果表明利奈唑胺外泌体纳米材料可明显减少MRSA的存活,而游离利奈唑胺对胞内MRSA几乎无抑制作用。机理研究表明,和游离利奈唑胺相比,外泌体可靶向递送利奈唑胺进入巨噬细胞内并且能在胞内大量蓄积,另一方面,外泌体进入细胞后与溶酶体共定位,提示药物可到达MRSA在胞内的躲避场所,增加的胞内蓄积和相同的分布为抗生素在胞内发挥作用提供了良好的基础。这些结果提示外泌体可靶向递送抗生素进入细胞内,为治疗胞内菌感染提供了一种新的选择。(3)外泌体负载万古霉素治疗胞内MRSA的研究在超声条件下,将万古霉素载入小鼠巨噬细胞来源的外泌体,制备了万古霉素外泌体纳米材料。透射电子显微镜观察显示,超声载药后,外泌体的形貌发生了变化,粒径从约70 nm增大到130 nm,但并不影响细胞对其摄取。生物活性结果表明,该纳米材料能够明显提高万古霉素对胞内菌的清除效果。这一结果进一步证明了外泌体作为胞内抗生素传递载体的可能性。(4)外泌体负载Top I抑制剂calothrixin A治疗胞内MRSA的研究虽然Top I抑制剂calothrixin A具有较强的抗菌活性,但由于其细胞毒性在纳摩尔水平,限制了calothrixin A作为抗菌药物的开发。我们利用外泌体包裹calothrixin A,将其传递到巨噬细胞的细胞浆而不进入细胞核,活性评价结果表明其抗胞内菌效果与同样被外泌体包载的万古霉素相当。有趣的是,calothrixin A被外泌体包裹后,对巨噬细胞的毒性远低于游离calothrixin A。究其原因可能是游离calothrixin A进入细胞后能进入细胞核,而外泌体负载的calothrixin A跟随外泌体进入溶酶体而不能进入细胞核与拓扑异构酶结合,从而不能发挥抑制细胞生长的作用。这一策略正好给calothrixin A发挥胞内抗菌作用提供了可能,同时也为其他类似的广谱化合物发挥胞内抗菌作用提供了一种新的选择。(5)表面功能化的外泌体制备将小鼠巨噬细胞用含有L-azidohomoalanine(AHA)的培养基培养,从培养液中分离纯化获得AHA外泌体。并设计合成了DBCO-RohB荧光染料与AHA外泌体发生点击反应,通过测定外泌体的荧光强度证明外泌体被成功标记上叠氮基团。进一步地,将DBCO-RohB标记的外泌体与巨噬细胞共孵育,考察功能化修饰的外泌体被细胞的摄取情况以及运载货物的能力。结果表明DBCO-RohB外泌体很容易被巨噬细胞吞噬,并且能将负载货物传递进入细胞。外泌体作为一种优良的药物载体,但其缺点之一是缺乏靶向性。外泌体被叠氮化后,可通过点击反应将目标配体结合到外泌体表面上,这将外泌体作为一种新型纳米载体靶向递送药物成为可能。(6)甘露糖修饰的外泌体负载抗菌药物靶向治疗巨噬细胞内MRSA感染合成甘露糖-DBCO功能团,利用含叠氮基团的外泌体与甘露糖-DBCO发生点击反应,获得甘露糖基化外泌体。细胞摄取结果表明,甘露糖基化外泌体可被巨噬细胞有效摄取,相对于对照外泌体,其内化能力更强。在超声条件下,外泌体成功负载万古霉素或溶葡萄球菌酶,并且不改变抗菌药物的活性。药效实验结果显示,甘露糖基化外泌体增强抗菌药的胞内抗菌作用,同时负载万古霉素或溶葡萄球菌酶的两种外泌体联合给药会显著增强胞内杀菌作用。总之,将胞内抗菌作用弱的利奈唑胺、万古霉素或溶葡萄球菌酶包载进入外泌体,并且还尝试将具有胞外抗菌作用但对细胞具有毒性的TOPI抑制剂CAA包载进入外泌体,制备含抗菌药的外泌体;此外,通过代谢标记外泌体表面蛋白质,经Click反应,形成具有甘露糖配体修饰的外泌体,负载抗菌药物后,靶向巨噬细胞。另外,本文设计构建了小鼠巨噬细胞内MRSA感染模型和小鼠腹腔感染模型,系统地评价了负载抗菌药物的外泌体对巨噬细胞内MRSA的抗菌作用,体内分布,以及对细胞的毒性作用。最后,还检测了外泌体进入细胞后的胞内命运,分析了含抗菌药物的外泌体在细胞内发挥抗菌作用的机制。这些研究为外泌体作为抗菌药物递送系统在胞内感染方面的应用提供一定的理论依据和新的研究平台。