【摘 要】
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乳腺是哺乳动物泌乳的主要器官,脂肪酸代谢在泌乳过程中非常活跃。Micro RNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的内源性非编码RNA,能通过靶基因参与细胞生命活动的调控,包括脂质代谢过程。miR-424-5p在奶山羊不同泌乳时期表达量差异显著,但目前尚无关于miR-424-5p调控奶山羊乳腺脂质代谢的研究报道,因此奶山羊miR-424-5p的转录调控研究对反刍动物脂质合成的机制具有
【基金项目】
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国家自然科学基金（编号:31772575）；
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乳腺是哺乳动物泌乳的主要器官,脂肪酸代谢在泌乳过程中非常活跃。Micro RNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的内源性非编码RNA,能通过靶基因参与细胞生命活动的调控,包括脂质代谢过程。miR-424-5p在奶山羊不同泌乳时期表达量差异显著,但目前尚无关于miR-424-5p调控奶山羊乳腺脂质代谢的研究报道,因此奶山羊miR-424-5p的转录调控研究对反刍动物脂质合成的机制具有重要意义。本研究以奶山羊乳腺上皮细胞为研究材料,探究miR-424-5p对细胞脂肪酸代谢的调控作用;利用生物信息学及双荧光素酶报告系统预测并验证了miR-424-5p直接靶向INSR基因的3`UTR发挥调控作用;采用过表达质粒和si RNA干扰的方法探究靶基因INSR对乳腺上皮细胞脂质代谢的影响,从而揭示miR-424-5p通过INSR调控奶山羊乳脂代谢的分子机制。主要研究结果如下:1.miR-424-5p对乳腺上皮细胞脂肪酸代谢的影响。过表达miR-424-5p显著上调乳腺上皮细胞甘油三酯和脂滴的积累,脂肪酸代谢相关基因FASN的m RNA表达水平显著下调（P<0.05）,DGAT1和SCD1 m RNA表达水平显著上调（P<0.05）;抑制miR-424-5p的表达后,甘油三酯含量显著下调（P<0.05）,脂滴含量有下降趋势但不显著（P>0.05）,脂肪酸延伸相关基因ELOVL6 m RNA表达显著上调;表明miR-424-5p能够参与乳腺上皮细胞脂代谢的调控过程。2.生物信息学分析显示INSR基因是miR-424-5p的靶基因之一,过表达或抑制miR-424-5p可导致INSR基因m RNA表达水平显著降低或升高（P<0.01）,双荧光素酶报告试验证明miR-424-5p靶向抑制INSR基因的表达。3.根据Gen Bank中山羊INSR基因预测序列设计PCR引物,克隆得到山羊INSR基因的CDS序列。序列长度为4110 bp,编码1369个氨基酸,蛋白分子量为154.75KDa,主要位于细胞膜上。同源性分析结果显示,奶山羊INSR与山羊亲缘关系最近,其次是绵羊,与小鼠亲缘关系最远。4.通过pcDNA3.1-INSR重组质粒上调乳腺上皮细胞中的INSR基因m RNA和蛋白表达水平,细胞内甘油三酯含量和脂滴积累降低（P<0.01）,脂肪酸C18:0、C18:1含量升高（P<0.05）,脂代谢相关基因DGAT1、SCD1 m RNA表达水平显著下调（P<0.05）;此外,过表达INSR显著上调了Akt和m TOR蛋白的磷酸化水平（P<0.01）。表明过表达INSR基因通过激活Akt/m TOR信号通路抑制乳腺上皮细胞脂质的合成。5.利用siRNA技术干扰INSR基因mRNA和蛋白的表达水平,细胞内甘油三酯含量和脂滴积累增加（P<0.05）,脂代谢相关基因FASN、ACACA、ELOVL6的m RNA表达水平显著下调（P<0.05）,DGAT1、DGAT2的m RNA水平显著上调（P<0.01）,脂肪酸成分及含量无显著变化（P>0.05）;干扰INSR显著下调了Akt、m TOR蛋白的磷酸化水平（P<0.05）,表明干扰INSR通过影响Akt/m TOR信号途径促进乳腺上皮细胞脂质合成。以上研究结果表明,miR-424-5p通过INSR基因调控山羊乳腺上皮细胞乳脂代谢过程。本研究为miRNA对奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸代谢的调控网络和作用机制提供了理论和试验依据。
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