存在于细菌和古细菌中的获得性免疫防御机制经过人为改造后,广泛应用于科学研究工作中,于2002年正式命名为CRISPR/Cas系统。该系统经过人为改造后,仅需一条单链RNA就能引导效应因子对特定靶点进行有效切割。2类V型效应因子因其在远离PAM序列位置进行切割,能形成黏性末端等特点而备受关注,该类效应因子中的AsCas12a蛋白因对哺乳细胞具有良好编辑活性而研究广泛,其中不少致力于拓展其PAM识别特异性从而拓宽其靶向范围。来自毛螺旋菌属Lachnospiraceae bacterium ND2006的LbCas12a在植物基因组编辑中呈现良好编辑活性,但对于拓展该蛋白PAM识别能力的研究甚少。随着植物基因组研究工作的深入,拓展该蛋白的靶向编辑范围成为需要。因此,本文从以下三个方面开展研究。首先,进行研究工作的前提是确定蛋白质的突变范围。该蛋白的晶体结构已被解析。已有的研究工作表明,围绕PAM双链结构周围距离最近的氨基酸即为影响PAM识别能力的关键氨基酸。因此,在蛋白质数据库PBD中下载LbCas12a蛋白晶体结构后,通过Pymol软件找出关键位点,共10个,分别为T149、T152、D156、Q529、G532、K538、D541、Y542、K591、K595。其次,为了了解由空间结构信息所得氨基酸残基对LbCas12a蛋白PAM识别能力的影响,构建并利用负筛选系统对10个位点的丙氨酸突变体进行丙氨酸扫描,逐一确认10个位点影响PAM识别能力的程度,从而确定核心关键位点。结果显示,10个位点中有4个位点对蛋白野生型PAM识别能力有显著影响,据数据分析总结,其影响程度从大到小依次为K595,T149,K538/D156,其余6个位点丙氨酸突变的引入对野生型PAM的识别能力未产生影响。最后,为了更全面的考察关键位点对PAM识别特异性的影响,将10个位点分别突变为精氨酸,构建6个N随机PAM文库,再通过负筛选系统结合高通量测序及生物信息学处理确认突变体、野生型蛋白的偏好PAM。分析结果显示,野生型蛋白在本实验中展示出对TYTV的特异性偏好,十个位点单氨基酸突变的引入对PAM的特异识别产生了四种不同的影响,一是突变的引入对蛋白PAM识别偏好性不产生影响,这些突变为 T149R、T152R、D156R、Q529R、D541R、Y542R,二是突变的引入加强了对d（-3*）位T的偏好,产生该影响的突变有G532R、K538R,三是突变的引入将d（-2*）位的识别拓展为W（A/T）,即K595R突变,四是突变的引入将d（-2*）位的识别拓展为W（A/T）,同时还增强了 d（-3*）位对T的识别偏好,即K591R突变。随机选取各个类型的位点,即T152、G532、K591、K595进行随机组合突变,得到11个组合突变体,负筛选系统确认组合突变体的PAM识别偏好,得到能够识别非标准PAM的K591R/K595R突变体,其松弛的PAM均为TYWV。为了验证该结果,构建正筛选系统验证其在d（-2*）位的松弛,结果证实了突变体在d（-2*）位对A的识别能力。