研究背景类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性破坏性关节病变为主要特征的全身性自身免疫病。由于RA的早期症状不突出,待出现临床及影像学改变时,病情常发展到疾病晚期且已发生了不可逆的损害,故早期诊断、早期治疗及个体化治疗对RA至关重要。有研究显示RA患者的死亡率是正常人的3倍,其中因心血管病造成的死亡率占一半以上,导致死亡的主要因素是心血管病变,但是传统的诸如男性、肥胖、高脂血症,高血压和家族史等心血管疾病危险因素,并不能完全解释RA合并CHD的高发率。基础研究己证明,冠心病(coronary heart disease,CHD)与RA有共同的炎性机制,RA本身就是早发动脉粥样硬化和冠心病的独立危险因素。2015年欧洲风湿病防治联合会(EULAR)明确提出了对RA患者心血管疾病的建议,由此可见,RA合并CHD的危害极大,发现RA患者中潜在的可改变的心血管疾病危险因素,并找到有效的能够检测并预防RA患者发生CHD风险的标志物,在实际工作中具有重要的临床意义。近年来,环状RNA(Circular RNA,circRNA)的诊断价值已经成为了研究领域的新热点。circRNA具有独特的闭合环状结构,对基因的表达有重要调控作用,可直接影响蛋白质表达也可间接影响miRNA表达,致使miRNA和蛋白质表达失调;不仅在生物的发育过程中发挥重要的生物学功能,而且在疾病的诊断和治疗中也发挥重要作用。研究发现,circRNAs在很多疾病,包括神经系统和心脑血管系统疾病如阿尔茨海默病和动脉粥样硬化性心血管疾病,还有自身免疫性疾病、糖尿病及各种肿瘤中扮演着重要角色。利用基因芯片技术,可以对来自不同组织和不同细胞中circRNA表达谱进行研究,circRNA的组织特异性,疾病特异性和较高稳定性,有具备成为良好生物标志物的条件,circRNA独有的竞争性内源(ceRNA)特征,可以为开发药物提供更广阔的思路,毋庸置疑,研究circRNA可以为探讨生命打开一扇新窗,不远的未来,circRNA将在各种疾病的预防、诊断、治疗及预后中发挥举足轻重的作用。课题组的前期研究中,通过设置RA合并CHD患者组、单纯RA组、单纯CHD组和健康对照组,运用circRNA芯片技术分析血浆中circRNA的差异表达,筛选出表达差异倍数大于1.5倍以上,且具有统计学意义的circRNA:RA合并CHD组与健康人群组232个:RA合并CHD组与单纯RA组95个:RA合并CHD组与单纯CHD组473个。初步确定5个circRNA基因在RA合并CHD患者中与其余3组在血浆中存在较为明显表达差异,包括:circR-0007850、circR-0403658、circR-0100332、circR-0092388和circR-0007260,本课题拟采用q-PCR进行进一步验证和筛选,并结合临床相关指标对其诊断效能进行评价,是在前期课题基础上更深入的研究。目的探索差异表达的circRNA作为RA合并CHD的临床诊断生物标志物的可行性及临床意义。研究方法第一部分 q-PCR对5个血浆circRNAs的验证和筛选1.1研究对象选取2016年6月-2017年4月在玉溪市人民医院(昆明医科大学第六附属医院)住院患者及健康体检者,设置四个组:(1)RA并发CHD组20例;(2)单纯RA组20例;(3)单纯CHD组20例;(4)健康对照组20例。以RA并发CHD组为基准,以性别和年龄为匹配条件,采用个体尽量完全匹配。冠心病患者均由冠状动脉造影检查确定冠心病诊断。对于典型RA采用1987年美国风湿病学会(ACR)的分类标准,对于不典型及早期RA,为避免误诊或漏诊,可按照2010年美国风湿病协会(ACR)/欧洲抗风湿病联盟(EULAR)标准诊断。1.2方法依据前期基因芯片技术分析得到的结果,采用荧光定量PCR(q-PCR),对初步确定的5个circRNA基因(circR-0007850、circR-0403658、circR-0100332、circR-0092388、circR-0007260)进行进一步验证和筛选。1.3统计学方法荧光定量结果采用2(-Δ Ct)法计算不同组织之间的基因表达变化。统计学分析采用平均数±标准差方式。四组间样本的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),以p<0.05为具有统计学差异。第二部分结合临床相关指标对筛选出的3个circRNAs诊断效能进行评价2.1研究对象选取2016年6月-2017年6月玉溪市人民医院住院RA合并CHD患者30例为研究组,同时匹配同期住院的年龄、性别和例数。设立单纯RA组、单纯CHD组和健康对照组各30例。以RA合并CHD组为基准,以性别和年龄为匹配条件,采用个体尽量完全匹配。研究对象的排除及入选标准同1.1。2.2方法在独立样本中,采用q-PCR对经第一部分最终筛选出的3个circRNA进行检测,同时检测血脂指标、心肌指标、炎性及自身抗体指标、凝血指标、血常规指标和血沉指标,结合临床常规指标进行相关性统计分析,采用ROC曲线评估其作为RA合并CHD诊断标志物的临床价值。2.3统计学方法荧光定量结果采用2(-ΔCt)法计算不同组间基因表达的变化。统计学分析用平均数±标准差方式。以spss22.0和DPS数据分析系统(V14.10高级版)进行统计分析,非参数Mann-Whitney检验用于比较RA合并CHD与其他三组之间circRNA的差异表达,组间q-PCR结果差异倍数采用DPS数据分析系统(V14.10高级版)Tukey法分析,以P<0.05为具有统计学意义。采用ROC曲线下面积评估诊断指标的精确性,采用Pearson单因素相关分析,分析circRNA的表达水平和一些临床指标之间的相关性,评价常规心血管疾病诊断指标及表达差异的circRNA单一和联合在诊断RA合并CHD中的可行性和应用价值。结果第一部分 q-PCR对5个血浆circRNA的验证和筛选经验证,以RA合并CHD组为研究对象,circR-0007850与单纯CHD 比较上调4.41倍;circR-0403658与单纯RA和健康对照比较分别下调0.07倍和0.05倍,比单纯CHD上调2.50倍;circR-0100332比较单纯CHD和健康对照分别上调10.57倍和6.80倍;circR-0092388比较单纯CHD和健康对照分别上调2.61倍和2.52倍,此4个circRNAs验证结果与基因芯片筛查结果基本一致,而circR-0007260经验证与三组比较表达无差异。经统计分析,筛选出circR-0007850、circR-0100332和circR-0092388进入后续诊断效能评价。第二部分 结合临床相关指标对筛选出的3个circRNA诊断效能进行评价1、circR-0007850比较单纯CHD组表达有统计学意义(P<0.05,Fold chang为3.31,);circR-0100332和相比健康对照、单纯RA和单纯CHD组表达均有统计学意义(P<0.05,Fold chang分别为4.01、0.62和2.88),circR-0092388和相比健康对照、单纯RA和单纯CHD组表达有统计学意义(P<0.05,Fold chang分别为1.60、0.62和 1.57)。2、与临床传统指标进行相关性分析,circR-0007850与CK-MB负相关(r=-0.471,P=0.018),与凝血指标PT、TT正相关(r=0.409、0.384,P=0.037、0.047),与PCT负相关(r=-0.456,P=0.022);circR-0100332与CK-MB负相关(r=-0.409,P=0.037),与TT正相关(r=0.611,P=0.002),与PCT负相关(r=-0.382,P=0.048);circR-0092388与LDL-C呈负相关(r=-0.382,P=0.048),与 APTT正相关(r=0.592,P=0.003),与 WBC负相关(r=-0.418,P=0.033),三个circRNA与炎症指标PCT、CRP、IL-6及类风湿相关指标ACCP、RF均无相关性;3、采用ROC曲线进行诊断性能评价circR-0007850、circR-0100332和circR-0092388,其诊断RA合并CHD ROC曲线下面积分别0.190(95%CI,0.059-0.321)、0.788(95%CI,0.650-0.927)、和 0.215(95%CI,0.078-0.352)。对circR-0007850、circR-0100332、circR-0092388 诊断类风湿合并冠心病的性能进行评价,其诊断敏感性分别为:53.3%、76.7%和56.6%;诊断的特异度为:93.3%、96.7%和90.0%;诊断符合率为:56.6%、86.7%和73.3%。结论1.通过验证circR-0007850、circR-0403658、circR-0100332、circR-0092388在RA合并CHD患者中表现为明显的上调,这提示可能与RA合并CHD的发生发展有一定关系。2.circR-0007850与临床指标CK-MB、PT、TT和PCT存在相关;circR-0100332 与 CK-MB、TT及PCT存在相关;circR-0092388 与 LDL-C、APTT和WBC存在相关性。3.circR-0100332作为标志物诊断RA合并CHD具有重要参考价值。