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前言1966年Elmslie首次提出胰胆反流的学说,发现它可引起胆管上皮化生、胆总管囊肿,可发展为胆管或胆囊癌。胰胆反流还可以破坏胆汁胶态稳定性,推测与胆石形成有关。胰胆反流常见于胰胆管合流异常(Pancreaticobiliary maljunction;PBM),即胰胆管合流部较长(＞15mm),超过Oddi括约肌(Sphincter of Oddi;SO)收缩范围,胰液经胰胆管共同通道反流。Inagaki M和Horaguchi J等提出,在非PBM患者也存在隐匿性胰胆反流,即没有胰胆管合流形态学异常但胰液可反流入胆管而引起类似PBM的病理改变。胰胆反流如有肠激酶参与则迅速激活胰蛋白酶原,引起酶级联反应而加速胆管的刺激损害等一系列病理过程。此过程与十二指肠液反流入胆管即肠胆反流相似,因此需要区别胰胆和肠胆反流。诊断两种反流的方法均有改进,如判断肠胆反流通过口服核素后检测胆汁中放射性活度的方法,判断胰胆反流通过磁共振动态观察胰泌素诱导后胆管直径的变化等方法,其敏感度和特异度明显提高。但目前尚存在应用范围局限和难以反映生理性反流等缺点而不能得以广泛应用,因此仍沿用测胆汁中淀粉酶(amylase;AMY)水平的方法,但其特异性较差。本研究通过口服核素方法和测胆汁中AMY、脂肪酶(lypase;LPS)水平的方法分别观察各胆道疾病中肠胆和胰胆反流的存在,同时采用蛋白印迹(westernblot)方法检测肠激酶(enterokinase;EK)和胰蛋白酶原-1(Trypsin-1)的存在来观察反流现象,并相互对比。用较好的诊断方法研究胆道疾病中两种反流的存在及与疾病的相关性。方法一、实验对象收集2007年1月至2008年8月,中国医科大学附属盛京医院收治的共151例胆道疾病患者,包括胆囊结石,胆囊息肉,胆管色素结石,胆管残石,胆总管囊肿和肝门部胆管癌行经皮经肝胆管穿刺(percutaneous transhepatic cholangialdrainage;PTCD)和梗阻性黄疸行内镜下鼻胆管引流(endoscopic nasobilliarydrainage;ENBD)患者。上述诊断是依据临床症状、放射学,内窥镜检查或手术所见和病理组织学检查的主要诊断。胆管残石和胆管色素结石组中的结石均呈泥沙样、棕色色素结石。ENBD管引流的病例行十二指肠镜乳头切开术(endoscopic sphincterotomy;EST),其余患者SO完整。二、标本采集及保存(一)标本采集72例胆囊胆汁和31例胆管胆汁在术中获取,其余的胆管胆汁分别通过T管、经皮经肝胆管引流(percutaneous transhepatic cholangial drainge;PTCD)管、ENBD管引流获取。所有胆汁样本在空腹超过12h时获取。(二)保存获得的胆汁立即保存在-80℃,直至分析。三、检测指标(一)生物化学方法测量胆汁中AMY活力所有胆汁样本用日立7170A生化分析仪,通过Gal-G2-CNP基质法测定AMY水平。血液内AMY正常值范围为20～115U/L,超过正常值上限判定为胰胆反流。(二)生物化学方法测量胆汁中LPS的活力在106例胆管胆汁随机抽取93例、在72例胆囊胆汁随机抽取60例,用日立7170A生化分析仪,通过DGGMR基质法测定LPS水平。血液内LPS的正常值范围为23～300U/L,超过正常值上限判定为胰胆反流。(三)western blot检测胆汁中Trypsin-1上样前处理:去除胆汁内碎石及各种残渣、脱盐洗涤,此后免疫沉淀。Western blot:检测用ECL化学发光法,25KD水平出现特异性条带者判定为Trypsin-1阳性。(四)口服放射性核素后检测胆汁中放射性活度对42例胆囊切除、胆道探查取石、T管引流术后的患者,入院后放开T管超过24h,保证T管引流通畅。检查前禁食一夜,口服1 mL含有185 MBq(5mCi)的99mTc-DTPA水,接着240mL水漱服,患者立即平卧位。经T管收集2h胆汁,取其中20mL,立即检测放射性活度。如果胆汁中可以检测到放射性活度,则判定该患者存在十二指肠胆道反流。(五)western blot检测胆汁中EK上样前处理同(三)。Western blot:检测用ECL化学发光法,300KD水平处出现特异性条带者判定为EK阳性。四、统计分析所得数据使用SPSS13.0统计软件进行统计,对各组数据应用Pearson相关分析、单因素方差分析、Kruskal-Wallis检验、Fisher精确检验以及卡方检验,设定P＜0.05为有统计学意义。结果一、判定胰胆反流,检测Trypsin-1与AMY和LPS方法之间的一致性检验(一)胆汁中AMY和LPS检测AMY水平,在106例胆管胆汁63例判定为胰胆反流阳性(59.43%);在72例胆囊胆汁36例判定为胰胆反流阳性(50.00%)。检测LPS水平,在93例胆管胆汁53例判定为胰胆反流阳性(56.99%);在60例胆囊胆汁16例判定为胰胆反流阳性(26.67%)。AMY和LPS水平对数转换后进行相关性分析,在胆管r=0.812(P＜0.001),在胆囊r=0.775(P＜0.001)。(二)检测胆汁中Trypsin-155例胆管胆汁经western blot检测到Trypsin-1的特异性条带而判定为胰胆反流阳性(51.89%);26例胆囊胆汁经western blot检测到Trypsin-1的特异性条带而判定为胰胆反流阳性(36.11%)。(三)判定胰胆反流,检测Trypsin-1与AMY/LPS方法之间的一致性检验在胆囊胆汁,Trypsin-1与AMY方法,Kappa值为0.611(P＜0.001);检测Trypsin-1与LPS方法,Kappa值为0.624(P＜0.001);在胆管胆汁,Trypsin-1与AMY方法,Kappa值为0.696(P＜0.001);检测Trypsin-1与LPS方法,Kappa值为0.806(P＜0.001)。诊断胰胆反流的AMY、LPS和Trypsin-1方法检测之间存在一致性(P＜0.001),在胆管胆汁LPS检测结果接近Trypsin-1。二、判定肠胆反流,检测EK与口服核素方法之间的一致性检验(一)口服核素检测42例行胆道探查T管引流术后的患者,有9例检测到放射性活度而判定为十二指肠胆道反流阳性(21.43%)。此9例患者2h引流的20mL胆汁中锝放射性活度为175.9±129.2KBq,2h胆汁引流量41.7±12.2mL;其余33例2h胆汁引流量46.4±19.2mL,两组间无显著性差异(P＞0.05)。(二)检测胆汁中EK42例行胆道探查T管引流术后的患者,有17例用western blot检测到EK的特异性条带而判定为肠胆反流阳性(40.48%)。(三)判定肠胆反流,检测EK与口服核素方法之间的一致性检验EK检测与核素检测方法,Kappa值为0.466(P＜0.001),核素检测(9/42)较EK检测方法(17/42)敏感度差,但无统计学意义(P＞0.05)。三、检测EK和Trypsin-1方法评价胆道疾病中胰胆反流和肠胆反流率在胆管胆汁,EK阳性率在残石组、胆总管色素结石组和ENBD组较PTCD组和胆总管囊肿组显著高(P＜0.05);Trypsin-1阳性率在PTCD组较其余四组显著低(P＜0.05)。在胆囊胆汁中,EK阳性率在各组之间无明显差异(P＞0.05);Trypsin-1阳性率在先天胆总管囊肿组较其他组显著高(P＜0.05)。结论1、Western blot测定胆汁EK和Trypsin-1方法同口服核素方法和AMY测定方法,也可以有效地反映肠胆反流和胰胆反流的存在。2、胆汁内AMY/LPS主要来源于胰腺。3、在胆管色素结石和T管引流组,胆汁中胰酶主要来源于肠胆反流,肠胆反流率与胆汁获取途径无关,考虑肠胆反流与色素结石形成有关。4、在胆总管囊肿组,胆汁中胰酶主要来自胰胆反流。5、在非先天胆总管囊肿、胆道疾病患者中隐匿性胰胆反流较常见。