血小板反应蛋白（Thrombospondins,Tsps）是进化上保守的细胞外基质糖蛋白。哺乳动物的Tsp在血管生成、伤口愈合和突触发生等生物学过程中发挥重要作用。血小板反应蛋白1（Thrombospondin1,Tsp1）是Tsp家族五个成员之一。Tsp1在哺乳动物肺、骨骼肌、肾脏、卵巢等多种组织中均有表达,具有激活转化生长因子TGF-β信号通路,调控创伤修复和肿瘤生长过程中血管生成等生物学功能。在真骨鱼中,由于其特有的第三轮基因组复制,绝大多数种类存在两个拷贝的tsp1基因即tsp1a和tsp1b。实验室前期原位杂交分析显示tsp1a和tsp1b在尼罗罗非鱼性腺中的表达存在差异,tsp1a表达于卵巢的颗粒细胞;tsp1b在精巢输出精管上皮细胞和卵巢的鞘膜细胞表达。目前对于Tsp1在脊椎动物性腺发育和配子发生的研究仅限于小鼠Tsp1的敲除导致卵巢形态发生改变和育性降低以及罗非鱼中tsp1a/b突变嵌合体对精子发生的影响,在生殖中的功能特别是在硬骨鱼类卵子发生中的功能还有待阐明。以尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）为对象,在实验室前期已经获得了F0突变体的基础上,本研究通过传代建系获得了tsp1a和tsp1b纯合突变体,重点分析其在卵巢发育和卵子发生中的功能。主要研究结果如下:1)tsp1a和tsp1b在罗非鱼卵巢中的表达模式。实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,q RT-PCR）分析表明tsp1a m RNA在孵化后5天（day after hatching,dah）的性腺中就有表达,并随着卵巢的发育表达不断升高,在180 dah（卵黄发生期）达到最高。为了研究Tsp1a的蛋白表达,本研究制备了Tsp1a的多克隆抗体。荧光免疫组化分析表明Tsp1a在卵原细胞和颗粒细胞中表达,且在初级生长卵泡颗粒细胞中表达较低,而在次级生长卵泡颗粒细胞中表达较高。荧光原位杂交分析显示,tsp1b在雌鱼未分化性腺的体细胞以及已分化卵巢的鞘膜细胞中表达。这表明tsp1a和tsp1b的表达模式存在明显差异。2)tsp1a突变对卵子发生的影响。实验室前期已经获得了F0代突变嵌合体,主要分析了tsp1a突变嵌合体的精巢表型。本研究通过传代建系成功获得tsp1a纯合突变鱼,并分析了其卵巢表型。在60 dah时,组织学分析显示tsp1a突变鱼卵巢发育和卵子发生与野生型相比没有明显异常。在120 dah时,组织学分析显示,tsp1a突变鱼卵巢中卵原细胞数量显著高于野生型（wild type,WT）鱼卵巢,II时相卵泡的数量显著低于WT鱼卵巢,而I时相卵泡的数量没有显著差异。tsp1a突变鱼的性腺成熟系数GSI（Gonadosomatic index）与WT鱼相比也没有显著差异。在180 dah时,与WT鱼相比,tsp1a突变鱼的GSI显著降低。形态学分析表明,WT鱼卵巢中含有不同发育阶段的卵泡,包括大量卵黄发生期的卵泡,而tsp1a突变鱼卵巢中含有大量初级生长阶段的卵泡,仅有少量卵黄发生期卵泡。统计学分析表明,tsp1a突变鱼卵巢中卵原细胞、I和II时相卵泡的数量显著高于WT鱼卵巢,而III和IV时相卵泡数量显著低于WT鱼卵巢。细胞增殖标志基因PCNA阳性的卵原细胞在tsp1a突变鱼中显著增多。与此相一致的是,转录组分析表明tsp1a突变鱼卵巢中DNA复制相关基因的表达显著上调,而抑制细胞增殖并促进细胞分化的环腺苷酸（Cyclic adenosine monophosphate,c AMP）和有丝分裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路相关基因的表达显著下调。此外,tsp1a突变鱼中雌激素合成酶编码基因cyp19a1a表达和血清雌激素水平均显著下调。这些结果表明,tsp1a突变会导致卵原细胞增殖增加而分化受阻,进而导致卵原细胞增多,次级生长阶段卵泡减少,血清雌激素水平降低。3)tsp1b突变对卵子发生的影响。实验室前期已经获得了F0代突变嵌合体,主要分析了tsp1b突变嵌合体的精巢表型。本研究通过传代建系获得tsp1b纯合突变鱼,并分析了其卵巢表型。在90 dah,组织学分析显示tsp1b突变鱼卵巢发育没有明显异常。在180 dah,形态学分析发现,WT鱼的卵巢中含有大量进行卵黄发生的卵泡,而tsp1b突变鱼卵巢中仅有极少量卵黄发生的卵泡。组织学分析显示,tsp1b突变鱼卵巢I和II时相卵泡的数量显著高于WT鱼卵巢,而III和IV时相卵泡的数量显著低于WT鱼卵巢。而tsp1b突变鱼GSI与WT鱼相比无显著差异。荧光免疫组化结果显示,在90 dah时,与WT雌鱼相比tsp1b突变雌鱼卵巢中的颗粒细胞标志基因amh、cyp17a1和cyp19a1a的表达均无显著差异,血清雌激素水平也无显著差异。在180 dah时,与WT雌鱼相比,tsp1b突变雌鱼卵巢中的amh、cyp17a1和cyp19a1a的表达均显著减弱,血清雌激素水平也显著下调。为了系统的研究tsp1b基因敲除对基因表达的影响,对90 dah时的tsp1b突变鱼和WT鱼的卵巢进行了转录组测序分析,结果表明tsp1b突变体中tsp家族相关基因的表达无显著差异,表明敲除tsp1b基因后其他的tsp成员没有补偿作用;而染色质组装相关基因的表达显著下调,细胞粘附相关基因和粘着斑相关基因的表达显著上调。对卵泡发育至关重要的卵泡细胞表达基因amh、cyp17a1和cyp19a1a的下调,以及与卵泡生长和分化相关的染色质组装相关基因的下调,可能是tsp1b突变体鱼中,血清雌激素水平降低和初级生长卵泡向次级生长卵泡过渡失败的原因。细胞粘附分子是参与卵巢内分泌细胞的识别和细胞间相互作用的重要因子其在tsp1b突变体鱼卵巢中表达是显著上调的。这些结果表明tsp1b突变对卵原细胞的增殖和初级卵泡发育没有影响,可能是因为细胞粘附分子和黏着斑相关基因的补偿作用。综上所述,本研究分析了tsp1a/b基因在罗非鱼卵巢的表达模式,证实了tsp1a和tsp1b在尼罗罗非鱼卵巢的表达发生了分化,tsp1a在卵巢的颗粒细胞中表达,而tsp1b在卵巢的鞘膜细胞中表达。缺失功能研究表明tsp1a突变导致卵原细胞和初级卵泡增加,次级卵泡减少,卵泡发育延迟。tsp1b突变对卵原细胞增殖没有影响,但导致初级卵泡不能向次级卵泡发育,卵泡发生停滞在初级生长阶段。因此,tsp1a或tsp1b纯合突变均会影响罗非鱼卵子发生过程,但表型存在差异。本研究通过基因表达和功能研究揭示了复制基因tsp1a/b在硬骨鱼类卵子发生中的功能,有助于拓宽和深化我们对Tsp1在脊椎动物卵子发生中的认识,又能为鱼类获得更高质量的卵子提供理论支持。