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肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)及其相应的受体超家族(TNFRSF)在细胞功能调控方面具有重要地位，其调控作用涉及细胞的多种行为，与机体的生理和病理过程密切相关。截止目前，至少对19种配体和29种受体进行了深入地研究。死亡受体6(DR6)，即TNFRSF21，是新近发现的TNFRSF成员，但其相应的配体至今没有报道。本研究首先采用细菌双杂交系统在人肝细胞cDNA文库中筛选得到了可能与DR6相互作用的分子，对其中的hepsin与maspin进行了重组表达，在胺化磁珠上证实了重组蛋白与DR6的结合。本研究还编写了基于蛋白质密码理论的多肽筛选软件，应用该软件从hepsin与maspin分子中筛选到了可能与DR6相互作用的多肽序列，选择合成了其中部分多肽，在细胞模型上观察到了这些多肽诱导细胞凋亡的作用。这些结果表明：hepsin与maspin可能为DR6的配体或相互作用蛋白。 一、细菌双杂交系统在细胞外蛋白质相互作用研究中的应用 利用已知的TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)与其3个受体(DR4、DR5、OCIF／OPG)相互作用的关系，分析细菌双杂交系统研究细胞外蛋白相互作用的可行性。以带四环素(T)抗性的pTRG构建编码TRAIL细胞外可溶性区域表达质粒；以带氯霉素(C)抗性的pBT构建编码DR4，DR5，OCIF／OPG的细胞外区域序列质粒。所构建的质粒分别相应共转化带卡那霉素(K)抗性的报告菌株XL1-Blue MRF，铺于含250～500μg／ml羧苄青霉素(C)，15μg／ml四环素(T)，34μg／ml氯霉素(C)，50μg／ml卡那霉素(K)的15 cm的LB平皿(LB-CTCK)，即报告基因产物以抗羧苄青霉素作为转录激活的指标，然后再以β-半乳糖苷酶活性进行验证。所构建的pTRG-TRAIL与pBT-DR4，pTRG-TRAIL与pBT-DR5及对照组分别共转化后，在500μg／ml羧苄青霉素的LB-CTCK筛选下宿主菌呈转录激活状态，pTRG-TRAIL与pBT-OPG组共转化后在250μg／ml羧苄青霉素筛选下宿主菌呈转录激活状态。阳性克隆皆可在X-Gal-PETG-TCK平皿可以进一步验证。对照组pTRG-TRAIL与pBT-LGF2，pBT-DR4与pTRG-Gal11，pBT-DR5与pTRG-Gal11或pBT-OPG与pTRG-Gal11四组共转化后呈阴性。 由于所用的双杂交序列皆为编码TRAIL受体的细胞外区域，而这些蛋白质之间 王粤华博士学位论灰死亡受体6相王作用蛋白质的饰迄与鉴定的相互作用已有验证，由此证实了细菌双杂交可以用于细胞外蛋白质相互作用的研究。同时证实了OCIF/OPG与TRAIL能直接结合，但亲和力较TRAIL与DR4、TRAIL与DRS要低。二、细菌双杂交系统筛选与DR6相互作用的分子 以pBT构建编码DR6细胞外区域(43一234aa)与Fc片段融合表达的质粒，与Stratagene公司购买的细菌双杂交用人肝细胞cDNA文库(以pTRG构建)共转化xLI一Blue MRF，铺于250协g/m1梭节青霉素的LB一cTCK平皿。24h后长出大量菌落 (>300个/平皿)，随机挑选10个克隆进行测序，结果显示筛选到的主要是与Fc片段结合的蛋白编码序列。提高梭节青霉素浓度至500卜g/ml阳性克隆略有减少(约100个/平皿)。 将DR6细胞外区域编码序列直接插入pBT，按上述方法在500林g/ml羚节青霉素的LB一CTCK平皿上筛选了8轮次，共计360余块15 cm平皿，每次的转化效率在2x107一6xlo7间。结果共得到1200余个阳性克隆，用x一Gal一PETG平皿进一步验证，得到了约300个阳性克隆，全部进行了插入片段的序列分析。剔除已知只存在于细胞内(如核内、胞浆、线粒体等)的蛋白编码序列，共12次得到抗胰蛋白酶(alphal一antitryPsin)，4次hePsin，2次未知的同一新基因，2次白蛋白，2次补体IY亚单位，2次转铁蛋白(ferritin)及maspin、克隆刺激因子1受体、A一n脂蛋白、c脂蛋白、C反应蛋白、视黄酸受体a、血清类粘蛋白1、血清素等编码序列各1次。调研文献分析所报道这些蛋白的功能和研究现状，选择了H型跨膜蛋白丝氨酸蛋白酶家族分子hePsin与丝氨酸蛋白酶抑制剂家族分子maspin进行进一步研究。三、重组表达hcPsin与masPin，胺化磁珠法分析与DR6的结合 设计相应的引物，以肝细胞cDNA文库为模板，PCR扩增了其中的 hePsin细胞外区域和maspin成熟肤的编码序列，插入pMALTM Protein Fusion and PurifieationSystem(New England Biolabs公司)中的pMAL一eZ载体，进行与麦芽糖结合蛋白 (MBP)融合的原核重组表达。表达产物用试剂盒所带的直链淀粉亲和层析柱初步纯化，达到电泳纯。DR6细胞外区域同样表达并纯化。 将hepsin、maspin及MBP蛋白分别共价结合于旺源胺化(NHZ一terminated)磁珠 (云南旺源生物科技有限公司，WB 130)上，再用过量的人血白蛋白饱和磁珠。各组各分成2管，1管加入适量纯化的重组表达的DR6，另l管以MBP为对照，4℃轻摇王架毕博士檬位论失死亡受体6相王作用番白质的拜透与鉴定lh。分别分析DR6、MBP加入前、后蛋白浓度的变化。结果DR6浓度在hepsin与ma印in实验组显著降低，而MBp浓度基本无变化，说明DR6与hepsin或maspin能相互结合。四、基于蛋白质密码理论编写分析软件，以验证masPin和hcPsin中与DR6的结合区域 蛋白质密码理论认为，蛋白质分子相互识别的信息储存于它们的编码DNA序列中，编码受体/抗原基因的反义核营酸序列中的