论文部分内容阅读
日本血吸虫病人兽共患，危害严重。然而，目前有关血吸虫与宿主互作的机制认识仍非常有限。大量研究显示，分泌型的外泌体(exosomes)在病原体与宿主互作中发挥重要的调控作用。为此，本研究以日本血吸虫exosomes的调控功能研究为切入点，分离并鉴定日本血吸虫exosomes中的组份，研究虫源性exosomes在细胞中迁移情况和作用效应，特别是对宿主肝脏细胞和免疫细胞的影响，进一步鉴定虫源性exosomal miRNAs对宿主及虫体靶向基因的调控机制。预期研究结果将从exosomes视角揭示日本血吸虫与宿主互作的寄生调控机制，为探讨血吸虫病的防治手段提供新思路。
1.日本血吸虫exosomes分离和鉴定
结合透析、超滤、超速离心和商用抽提试剂盒，筛选日本血吸虫exosomes的分离和纯化方法：利用透射电镜观察exosomes的形态：运用质谱、测序以及生物信息学技术研究exosomes中的蛋白和RNA组份，分析组份的潜在功能。结果显示分离出的日本血吸虫exosomes直径大小在50-100nm。质谱结果共鉴定出403个蛋白，这些蛋白主要参与结合、催化、翻译调节等过程。Small RNA测序鉴定出了15个已知的虫源性miRNAs(cut-off reads ＞100)，另有约1，284，966 reads (3.4%，2，540个unique small RNAs)能与宿主基因组匹配，其中包括一个宿主源性的miRNA ocu-miR-191-5p(4，548 reads)，表明日本血吸虫exosomes中既包括虫源性的遗传信息也包含宿主源性的信息，其可能参与虫体发育及血吸虫致病过程。
2.虫源性exosomes调控宿主肝脏功能
体外，将虫源性exosomes与肝细胞共孵育，利用荧光素标记虫源性exosomes表膜蛋白，采用荧光显微技术观察虫源性exosomes的迁移情况；运用qRT-PCR技术研究共孵育后的宿主肝细胞中虫源性的exosomal miRNAs的表达情况，鉴定虫源性exosomes能否传递虫源性信息到宿主肝细胞中。结果发现，共孵育后，虫源性miRNA可以在宿主细胞中检测到，其潜在宿主靶基因表达下调，表明日本血吸虫exosomes可以被宿主肝细胞吸收，且将虫源性的miRNAs传递到肝脏细胞，调控宿主肝细胞靶基因的表达。
3.虫源性exosomes介导的免疫调控效应
将虫源性exosomes与巨噬细胞共孵育，荧光分别标记虫源性exosomal蛋白和RNA，荧光显微镜观察exosomal蛋白和RNA在巨噬细胞中的迁移情况：运用ELISA及qRT-PCR等技术检测宿主免疫细胞因子表达变化，结合测序技术研究共孵育后宿主细胞mRNA表达谱变化;此外，建立小鼠过敏反应模型，将虫源性的exosomes注射进入小鼠体内，研究虫源性exsomes对小鼠免疫应答的调控作用，初步探讨虫源性exosomes介导的免疫调控效应。结果显示，虫源性exosomes可以被巨噬细胞吞噬，释放虫源性exosomal蛋白和RNA至巨噬细胞，且刺激细胞因子IL-13，TNF和IL-5的释放，调控宿主Th2型免疫应答。
4.虫源性exosomal miRNA Bantam通过靶基因CLMP调控宿主TNF信号通路
生物信息学方法预测虫源性exosomal miRNA Bantam在宿主中的潜在靶基因，将预测结果与exosomes共孵育后宿主细胞mRNA表达谱结果相比较，筛选潜在的靶基因，检测其在感染日本血吸虫小鼠组织中的表达，利用荧光素酶方法验证靶基因。体外转染Bantam mlmics至巨噬细胞，研究Bantam对细胞增殖和凋亡的影响及其潜在调控途径。结果筛选到3个潜在宿主靶基因CLMP、FAM212B和PRTG，其在感染日本血吸虫的宿主组织中下调。转染Bantam至巨噬细胞导致细胞中CLMP表达下调，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，同时激活TNF信号通路，表明虫源性exosomal miRNA Bantam可能是通过调控其宿主靶基因CLMP介导宿主TNF信号通路诱发宿主病理损伤。
5.虫源性exosomal miRNA Bantam调控虫体发育
选择与虫体发育相关的exosomal miRNA Bantam,体外培养日本血吸虫，利用RNAi方法将anti-Bantam电转进入虫体内，激光共聚焦方法观察抑制Bantam后虫体形态变化，同时利用RT-PCR方法检测Bantam干扰不同时间段后，虫体Bantam靶基因表达变化，初步探讨虫源性exosomal miRNA对虫体发育的影响。结果显示，体外抑制Bantam后，虫体卵巢破裂，卵巢实质面积减少，虫体靶基因表达上升，表明exosomal miRNA Bantam及其靶基因有可能是潜在血吸虫病防治的新药靶。
1.日本血吸虫exosomes分离和鉴定
结合透析、超滤、超速离心和商用抽提试剂盒，筛选日本血吸虫exosomes的分离和纯化方法：利用透射电镜观察exosomes的形态：运用质谱、测序以及生物信息学技术研究exosomes中的蛋白和RNA组份，分析组份的潜在功能。结果显示分离出的日本血吸虫exosomes直径大小在50-100nm。质谱结果共鉴定出403个蛋白，这些蛋白主要参与结合、催化、翻译调节等过程。Small RNA测序鉴定出了15个已知的虫源性miRNAs(cut-off reads ＞100)，另有约1，284，966 reads (3.4%，2，540个unique small RNAs)能与宿主基因组匹配，其中包括一个宿主源性的miRNA ocu-miR-191-5p(4，548 reads)，表明日本血吸虫exosomes中既包括虫源性的遗传信息也包含宿主源性的信息，其可能参与虫体发育及血吸虫致病过程。
2.虫源性exosomes调控宿主肝脏功能
体外，将虫源性exosomes与肝细胞共孵育，利用荧光素标记虫源性exosomes表膜蛋白，采用荧光显微技术观察虫源性exosomes的迁移情况；运用qRT-PCR技术研究共孵育后的宿主肝细胞中虫源性的exosomal miRNAs的表达情况，鉴定虫源性exosomes能否传递虫源性信息到宿主肝细胞中。结果发现，共孵育后，虫源性miRNA可以在宿主细胞中检测到，其潜在宿主靶基因表达下调，表明日本血吸虫exosomes可以被宿主肝细胞吸收，且将虫源性的miRNAs传递到肝脏细胞，调控宿主肝细胞靶基因的表达。
3.虫源性exosomes介导的免疫调控效应
将虫源性exosomes与巨噬细胞共孵育，荧光分别标记虫源性exosomal蛋白和RNA，荧光显微镜观察exosomal蛋白和RNA在巨噬细胞中的迁移情况：运用ELISA及qRT-PCR等技术检测宿主免疫细胞因子表达变化，结合测序技术研究共孵育后宿主细胞mRNA表达谱变化;此外，建立小鼠过敏反应模型，将虫源性的exosomes注射进入小鼠体内，研究虫源性exsomes对小鼠免疫应答的调控作用，初步探讨虫源性exosomes介导的免疫调控效应。结果显示，虫源性exosomes可以被巨噬细胞吞噬，释放虫源性exosomal蛋白和RNA至巨噬细胞，且刺激细胞因子IL-13，TNF和IL-5的释放，调控宿主Th2型免疫应答。
4.虫源性exosomal miRNA Bantam通过靶基因CLMP调控宿主TNF信号通路
生物信息学方法预测虫源性exosomal miRNA Bantam在宿主中的潜在靶基因，将预测结果与exosomes共孵育后宿主细胞mRNA表达谱结果相比较，筛选潜在的靶基因，检测其在感染日本血吸虫小鼠组织中的表达，利用荧光素酶方法验证靶基因。体外转染Bantam mlmics至巨噬细胞，研究Bantam对细胞增殖和凋亡的影响及其潜在调控途径。结果筛选到3个潜在宿主靶基因CLMP、FAM212B和PRTG，其在感染日本血吸虫的宿主组织中下调。转染Bantam至巨噬细胞导致细胞中CLMP表达下调，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，同时激活TNF信号通路，表明虫源性exosomal miRNA Bantam可能是通过调控其宿主靶基因CLMP介导宿主TNF信号通路诱发宿主病理损伤。
5.虫源性exosomal miRNA Bantam调控虫体发育
选择与虫体发育相关的exosomal miRNA Bantam,体外培养日本血吸虫，利用RNAi方法将anti-Bantam电转进入虫体内，激光共聚焦方法观察抑制Bantam后虫体形态变化，同时利用RT-PCR方法检测Bantam干扰不同时间段后，虫体Bantam靶基因表达变化，初步探讨虫源性exosomal miRNA对虫体发育的影响。结果显示，体外抑制Bantam后，虫体卵巢破裂，卵巢实质面积减少，虫体靶基因表达上升，表明exosomal miRNA Bantam及其靶基因有可能是潜在血吸虫病防治的新药靶。