【摘 要】
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胞膜窖是细胞膜表面特异性凹陷,主要由脂类和蛋白质组成,脂类包括磷脂、胆固醇、糖脂;蛋白质主要是窖蛋白的家族成员(Caveolin)。哺乳动物的Caveolin-1蛋白参与细胞代谢、信
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胞膜窖是细胞膜表面特异性凹陷,主要由脂类和蛋白质组成,脂类包括磷脂、胆固醇、糖脂;蛋白质主要是窖蛋白的家族成员(Caveolin)。哺乳动物的Caveolin-1蛋白参与细胞代谢、信号转导及肿瘤细胞双向调节作用而被广泛关注。本文通过5’和3’Race快速扩增技术成功得到七鳃鳗L-Caveolin-like基因全长序列,该基因全长为1817bp,5’-UTR为253bp,3’-UTR为784bp,ORF区为780bp编码259个氨基酸。利用生物信息学相关软件对L-Caveolin-like编码氨基酸序列的结构特征、理化性质进行预测分析。根据其他物种Caveolin蛋白与七鳃鳗L-Caveolin-like蛋白的同源性做出系统进化树,以确定其在各物种系统发育中的地位。将L-Caveolin-like连在p ET-30a原核表达载体上并转入大肠杆菌中进行诱导、表达、纯化得到可溶L-Caveolin-like蛋白,将其作为抗原免疫新西兰兔,纯化抗血清,制备了具有较高特异性的抗七鳃鳗Caveolin-like兔多克隆抗体。通过免疫印迹和免疫组化方法鉴定L-Caveolin-like在七鳃鳗的肠、肝、肾、鳃、髓、心脏等组织中都有表达,且在肠、肝组织中的表达量相对较高。构建七鳃鳗p EGFP-N1-L-Caveolin-like真核重组表达载体,通过脂质体转染Hela细胞,超高分辨显微镜显示L-Caveolin-like定位在Hela细胞的线粒体中。实时定量PCR检测线粒体COⅠ、Cyt C、PUMA基因的表达量下降,分析L-Caveolin-like在抗线粒体氧化应激、抗凋亡方面起到作用;细胞ATP水平上调,说明其具有维持线粒体产能防止线粒体损伤的作用;经LPS刺激的七鳃鳗肠组织L-Caveolin-like表达量与刺激前比较出现了显著性升高,推测当七鳃鳗受到外来病原体感染时L-Caveolin-like可以保护机体免受损害;另外,L-Caveolin-like过表达可以促使EGF、FGF、PDGF基因表达上调,说明其具有促增殖作用。综上所述,L-Caveolin-like在促细胞增殖、防止线粒体氧化应激、抑制凋亡过程中发挥重要作用,其具体作用机制还有待于进一步研究。
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