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研究背景胃癌是消化系统常见肿瘤,在世界范围,胃癌死亡率居世界第二位,虽然在发达国家,近年胃癌发病率有所下降,但在我国,根据最新的统计资料,我国城市胃癌的死亡率居恶性肿瘤死亡率的第三位,在农村,胃癌的死亡率甚至居于第一位。外科手术仍是其主要的治疗方法,但仅有30-50%的患者可获得根治性切除,虽然目前针对胃癌的药物及治疗方法较多,但疗效并不满意,究其原因,胃癌的早期转移是死亡率高的重要原因,故而研究胃癌早期转移的机制及其标志物就显得尤为重要了。2009年stein等人报道了MACC1(Metastasis-associated in colon cancer1)基因在肠癌中的可能作用,他们研究发现MACC1的表达水平与生存率明显相关,低表达的患者5年生存率为80%,而高表达者其5年生存率仅有15%。发生转移的患者的MACC1mRNA水平明显高于未转移患者(p<0.0001),Logistic和Cox回归分析表明,MACC1可以作为肠癌转移的预后指标引。继而出现大量的研究报道MACC1不仅在肠癌,而且与肝细胞癌、肺癌、胃癌等实体肿瘤的转移相关。其中,有学者发现在MACC1基因在发生血管转移的肝细胞癌中高表达,Shimokawa H等人收集了146例Ⅰ期肺腺癌术后标本,发现MACC1的表达水平与预后密切相关。而在胃癌中,目前有文献报道MACC1基因的表达与其腹膜转移相关。这些均表明MACC1在早期发现肿瘤转移及复发方面具有重要的指导作用,极有可能作为一个肿瘤预后的分子标志物。但是在胃癌方面的作用仍不深入,需进一步的探讨研究。研究MACC1基因功能,需要大量的体内体外实验,所以构建合适的MACC1表达载体是研究其结构功能的必要基础。目前国内尚未见构建胃癌MACC1表达载体的相关报道。本研究应用293FT细胞为模板,成功扩增出MACC1全长cDNA序列及MACC1表达的干扰片段,构建过表达载体及干扰表达载体,为研究该基因在多种类型肿瘤中的作用及机制奠定了基础。已有文献报道,胃癌中MACC1基因与其腹膜转移相关,为了进一步研究其作用机制,我们首次成功建立了稳定表达MACC1的胃癌pBaBb-MACC1/BGC-823细胞株及其MACC1基因沉默表达的细胞株sh-MACC1/BGC-823,并对MACC1的表达情况通过RT-PCR及Western blot进行验证分析,为探讨MACC1在胃癌中的作用机制提供了可靠保证。基因芯片又称DNA微阵列(DNA microarray),该技术是指将大量探针分了固定于支持物上,将样品分子标记,然后将两者进行杂交,利用相关软件收集杂交信号,从而获取样品分子的数量和基因信息。通过不同的探针序列的设计、不同的分析方法使得该技术的应用价值也各有不同,如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。随着20世纪80年代人类基因组计划的开展,结构基因组学已经得到了充分的认识,而功能基因组学方面仍存在太多的未知领域,基因芯片技术的出现给功能基因组的研究提供了一个全新的平台。基因表达谱芯片目前应用比较广泛,技术比较成熟,它可以检测整个基因组的各个基因mRNA的变化水平。传统的研究方法仅仅局限于某个或某几个基因和他们之间简单的调控关系,无法全面的认识和研究肿瘤整个发生过程中基因复杂的调控关系。而基因芯片恰恰能解决传统研究方法的不足之处,其以大规模高通量的方法研究成千上万的基因在不同状态下的表达,预测他们的功能,预测他们之间的复杂的相互调控关系。从基因水平研究肿瘤相关基因的变化,通过基因芯片技术筛选和检测肿瘤发生、发展及转移过程中的差异表达基因,不但可以从病理状态中寻找可能病因,也为早期的诊断及预后提供依据,基因芯片技术和临床的相互结合将为成为未来研究发展的一个必然趋势。胃癌的发生发展转移是多种因素的相互之间的作用、多个基因表达异常的结果,其具体分子机制至今仍未能阐明[7]。这就需要基因芯片技术帮助我们对其进一步的研究。本研究中我们通过基因转载技术,构建了MACC1过表达(pBaBb-MACC1/BGC-823)及沉默(sh-MACC1/BGC-823)细胞株,然后利用基因芯片技术对这两个细胞株进行检测分析,发现MACC1的改变引起细胞株基因的广泛改变,其中LHX9、PDK3及PLEKHA5与MACC1的表达趋势完全一致,IL8、MYO1A及OST-β则与MACC1的表达趋势完全相反,进而通过文献查阅,希望找到与MACC1相互调控的关系或与胃癌早期转移的相关性,为下一步的功能研究奠定了基础。目的1.通过基因转载技术建立稳定过表达MACC1基因的胃癌细胞株pBaBb-MACC1/BGC-823及稳定抑制其表达的细胞株sh-MACC1/BGC-823;2.利用基因芯片研究MACC1表达改变的细胞株pBaBb-MACC1/BGC-823、sh-MACC1/BGC-823及正常细胞株BGC-823之间的基因表达谱差异；3.寻找与MACC1表达趋势一致及相反的差异表达基因,探讨MACC1与差异表达基因之间可能存在的细胞信号通路或各方面调节机制的联系。方法1.以人胚肾293FT细胞为模板,经PCR扩增获全长MACC1cDNA序列,将目的基因序列及干扰目的基因的片段序列克隆入pBaBb-puro及pSUPERretro-puro表达载体,建立pBaBb-puro-MACC1过表达载体和pSUPERretro-puro-MACC1抑制MACC1基因表达的载体。经过酶切鉴定、测序并观察转染293FT细胞报告基因表达情况从而判断是否构建成功。将构建好的两个载体分别转染入人胃癌BGC-823细胞,感染结束后48h加入puromycin(0.5μg/m1)筛选阳性克隆,然后在培养瓶中扩增培养并传代建系。收集细胞的RNA,进行荧光定量PCR及Western blot检测MACC1在这些细胞中表达情况,并采用SPSS13.0统计软件进行处理,通过单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各组之间差异以鉴定稳定细胞株。2.委托上海康成生物工程有限公司完成基因芯片工作,采用NimbleGen表达谱芯片对MACC1基因转染前后的胃癌细胞株BGC-823的基因进行研究,该芯片包括45033个基因。分别提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,用NimbleGen进行标记,进而用NimbleGen杂交系统进行杂交和NimbleGen缓冲液试剂盒洗涤,芯片结果采用Axon Genepox4000B扫描仪进行扫描,通过NimbleScan软件读取数据,进行标准化等分析后输入Agilent GeneSpringGX软件进一步分析。差异基因的筛选标准为ratio>2,为避免实验误差,每个细胞株各重复3次。3.通过分析找出在pBaBb-MACC1/BGC-823细胞株中表达上调、sh-MACC1/BGC-823细胞株中表达下调及在pBaBb-MACC1/BGC-823细胞株中表达下调、sh-MACC1/BGC-823细胞株中表达上调的基因,利用qRT-PCR进行验证,并采用SPSS13.0统计软件进行处理,通过单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各组之间差异筛选出相关基因。通过文献的查阅,试图寻找与MACC1的相关性,为胃癌的早期转移研究提供依据。结果1.成功扩增全长的MACC1cDNA及干扰片段,经测序鉴定完全正确；转染293FT细胞可见清晰的绿色荧光表达,顺利构建了MACC1过表达及沉默的稳定细胞株,通过qRT-PCR及Western blot检测发现pBaBb-MACC1/BGC-823、 sh-MACC1/BGC-823急定细胞株构建成功。2.对过表达、沉默及正常的胃癌细胞株BGC-823进行基因表达谱分析后发现表达上调及下调基因多达数千种,这些差异表达基因的功能涉及多个方面,包括与细胞凋亡及周期调控、肿瘤发生进展相关、酶活性基因调控、信号转导转录及翻译活性调控等多个方面,找出在pBaBb-MACC1/BGC-823细胞株中表达上调、sh-MACC1/BGC-823细胞株中表达下调及在pBaBb-MACC1/BGC-823细胞株中表达下调、sh-MACC1/BGC-823细胞株中表达上调的基因LHX9、PDK3、PLEKHA5、IL8、MYO1A及OST-β六个基因,并对其进行qRT-PCR验证并和统计学分析,与基因芯片结果一致。3.查阅文献资料,对LHX9、PDK3、PLEKHA5.IL8、MYO1A及OST-β基因进行结构、功能等方面的研究分析,找出可能与MACC1的相关性或与肿瘤发生转移的相关性,为胃癌早期转移的进一步研究提供方向。结论1.我们成功建立了MACC1基因转染及抑制其表达的细胞株pBaBb-MACC1/BGC-823及sh-MACC1/BGC-823,通过验证表明其稳定表达,统计学分析具有显著性差异。2.应用基因芯片技术对3个细胞株差异基因进行筛选,发现MACC1基因的改变引起pBaBb-MACC1/BGC-823及sh-MACC1/BGC-823细胞株广泛的基因改变,找出与MACC1表达趋势一致及相反的6个基因,并对这些基因进行qRT-PCR验证,结果提示与基因芯片结果一致。3.MACC1基因转染胃癌细胞株BGC-823后引起的胃癌细胞基因表达谱广泛改变,这些基因的功能涉及肿瘤发生转移、细胞周期调控、蛋白转录翻译、信号转导转录等多个方面。4.对差异基因的分析发现MACC1基因引起胃癌细胞基因表达谱中一些非常重要的信号转导通路上分子的改变,其中与MACC1表达趋势完全一致和相反的基因可能与胃癌的发展转移存在相关性,但是与MACC1的关系尚待进一步研究。