论文部分内容阅读
目的:探究肺炎链球菌溶血素Ply是否导致巨噬细胞线粒体的损伤,并引起mtDNA释放到胞质;胞质中异常积累的mt DNA是否会进一步介导巨噬细胞I型IFN应答,从而影响宿主细胞和肺炎链球菌的相互作用。背景:S.pn是一种革兰阳性菌,其引起的感染在全球范围内,尤其在发展中国家具有较高的发病率和死亡率,成为威胁人类健康的一大重要病原菌。因此S.pn与宿主相互作用机制的研究有利于对防治S.pn感染提供新思路和新方法。过去的研究发现S.pn标准菌株D39可以诱导宿主IFN-β的应答,而ply基因缺陷后这种激活效应受到显著抑制。在前期实验中我们证实了纯化的Ply蛋白可诱导宿主巨噬细胞IFN-β的表达,但其机制并不清楚。通常认为I-IFN主要是由核酸物质所激活,故我们推测可能是某种宿主来源的核酸介导了Ply诱导IFN-β的过程。Ply具有损伤宿主细胞线粒体的能力,而线粒体的损伤导致了大量线粒体损伤相关分子模式释放,其中包含mtDNA这种核酸物质。mtDNA在胞质中可激活STING通路诱导IFN-β的表达。所以,我们提出Ply可能是通过导致巨噬细胞线粒体的损伤使得mt DNA释放到胞质,进而诱导了IFN-β的表达。主要研究方法1、通过检测线粒体损伤标志蛋白PINK1在巨噬细胞中的累积水平和线粒体膜电位的降低情况,以及电镜下巨噬细胞线粒体超微结构的改变来验证Ply是否导致巨噬细胞线粒体的损伤;进一步探讨Ply导致线粒体损伤的机制,并探索通过抑制这种损伤机制而保护线粒体的方法;最后通过PCR的方法检测Ply处理后的巨噬细胞的胞质中异常积累的mt DNA水平。2、确证Ply刺激是否导致巨噬细胞IFN-β的产生,并通过保护线粒体抑制mt DNA释放和构建mtDNA缺陷细胞的方法,探究mtDNA是否在Ply诱导IFN-β表达的过程中起着关键作用;利用sting缺陷细胞验证STING是否参与了Ply诱导的IFN-β的过程,并检测Ply刺激后STING下游分子的活化情况。主要研究结果1、Ply可导致巨噬细胞线粒体损伤标志蛋白PINK1的聚集,引起线粒体膜电位的降低以及线粒体的肿胀、空泡样变和嵴结构的破坏。Ply引起过度产生的mtROS是引起线粒体损伤的重要因素,利用mitoTEMPO抑制mtROS的产生可对线粒体起到保护作用。2、Ply可导致mtDNA释放到巨噬细胞胞质中,利用mitoTEMPO可抑制这种现象。3、Ply可诱导巨噬细胞IFN-β的产生,其信号机制是Ply所引起的异常积累的胞质mtDNA激活STING通路而介导的。总结与讨论本课题证实了肺炎链球菌毒力因子Ply可导致巨噬细胞线粒体的损伤。损伤后的线粒体释放出mtDNA到胞质中,后者激活了STING信号通路,从而诱导宿主细胞IFN-β的表达。这项研究揭示了一种新的肺炎链球菌诱导I型IFN应答的机制,发现了线粒体在这其中起到的关键作用。这将有利于我们深入认识细菌和宿主细胞相互作用的机制,寻找治疗肺炎链球菌感染及耐药的新靶点和新方法。