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第一部分:在胰腺癌炎症微环境下PP2A下游靶基因的预测目 的:炎症微环境与肿瘤发生发展之间存在着密切关系。前期研究发现胰腺癌的炎症微环境可以抑制PP2A(protein phosphatase 2A)的表达,而PP2A的抑制可促进肿瘤的发生发展。本部分旨在预测炎症微环境诱导下调PP2A从而促进胰腺癌进展的下游靶基因。方法:分别用巨噬细胞条件培养基(MCM,macrophage-conditioned medium,建立炎症微环境)及冈田酸(OA,okadaic acid,PP2A抑制剂)处理人胰腺癌细胞株PANC-1,随后进行基因测序。分析MCM处理组与其对照组的差异基因以及OA处理组与其对照组的差异基因,上述差异基因再通过Venn法筛选候选目标基因。结 果:在用MCM处理PANC-1细胞后,其测序结果显示有3316个基因表达上调,有2776个基因表达下调;在用OA处理PANC-1细胞后,通过分析其基因芯片结果我们发现有5161个基因表达上调,有5474个基因表达下调。把两者结果取交集后,显示表达均较对照组上调的基因有1197个,均较对照组下调的基因有1253个。而uPAR(urokinase plasminogen activator receptor)即为两者共同差异表达的基因,在用MCM及OA处理后,uPAR的表达显示出明显差异。结 论:uPAR可能是胰腺癌炎症微环境中PP2A促进胰腺癌的进展的下游靶基因。第二部分:炎症微环境促进胰腺癌进展的关键通路的验证目的:证实炎症微环境是否通过抑制PP2A上调uPAR表达从而促进胰腺癌的进展。方法:运用病毒感染技术建立PANC-1 Tet-ON、PANC-1 Tet-ON PP2Acα WT细胞株,并用MCM分别处理这两株细胞,检测这些细胞株中uPAR的表达,以此证明炎症微环境是否通过抑制PP2A来调控uPAR的表达。选用PANC-1细胞系,使用通路抑制剂PD98059(ERK)、EF24(NF-κB)、SP600125(JNK)及 GF109203X(PKC)分别处理,再用OA处理,而后检测uPAR的表达水平,从而探寻PP2A通过何种激酶通路调控uPAR的表达。结 果:在PANC-1 Tet-ON细胞中,过表达PP2Acκ后,再用MCM处理细胞,uPAR表达水平的上调趋势明显减弱;用PD98059、EF24、SP600125、GF109203X处理PANC-1细胞,再分别用OA处理,结果显示PD98059和EF24通路抑制剂处理组的uPAR表达水平在加入OA后上调趋势减弱。结论:炎症微环境可通过抑制PP2A从而上调uPAR的表达,而PP2A通过ERK及NF-κB激酶通路调控uPAR的表达,由此促进胰腺癌的进展。第三部分:uPAR与胰腺癌患者的预后关系目 的:分析uPAR在胰腺癌患者中的表达水平及与预后的关系。方法:运用GEPIA数据库分析胰腺癌患者癌与癌旁uPAR的基因表达、uPAR的表达水平与胰腺癌的病理分期以及uPAR的表达水平高低与胰腺癌患者OS及DFS的关系。结 果:在GEPIA数据库中,胰腺癌患者的癌组织中uPAR的表达水平显著高于正常组织;uPAR的表达水平与胰腺癌的病理分期相关;生存分析结果显示uPAR高表达组的OS及DFS较低表达组明显减短,且有统计学意义。结 论:uPAR的表达水平高与胰腺癌患者预后不良有关。第四部分:uPAR在体外对胰腺癌细胞增殖、迁移及粘附能力的影响目 的:探讨uPAR在体外环境下对胰腺癌细胞增殖、迁移及粘附能力的影响。方法:利用慢病毒感染细胞技术,建立敲减uPAR表达的胰腺癌PANC-1细胞株。用real-time PCR的方法验证病毒感染后,这些细胞株中uPAR的mRNA表达水平。运用western blot的方法在蛋白水平验证病毒感染后uPAR的表达水平。在上述细胞中,用MTT 比色法、细胞划痕、平板克隆的方法验证uPAR对胰腺癌细胞增殖、迁移及粘附能力的影响。结 果:选用慢病毒感染后uPAR稳定低表达的2株细胞系及阴性对照组,MTT实验、细胞划痕及平板克隆实验结果提示敲减uPAR后胰腺癌细胞的增殖、迁移及粘附能力均有显著下降。结 论:在体外环境下uPAR表达水平与胰腺癌细胞增殖、迁移及粘附能力呈正相关。第五部分:uPAR在体内对胰腺癌生长及血管生成的影响目 的:探讨uPAR在体内环境下对胰腺癌生长及血管生成的影响。方 法:建立uPAR敲减组及对照组裸鼠皮下移植瘤模型,而后完整剥离实验组移植瘤,比较uPAR敲减组与对照组的瘤体重量。把瘤体切片后行免疫组化,分析比较3组移植瘤中Ki67及CD34的表达。结 果:分析uPAR敲减组与对照组的瘤体重量可知,敲减组移植瘤瘤体重量显著小于对照组。免疫组化结果显示,在uPAR敲减组中Ki67及CD34表达水平均较对照组显著降低。结 论:在体内环境下uPAR表达水平与胰腺癌生长及血管生成呈正相关。第六部分:uPAR下游基因的生物信息学分析目 的:分析uPAR的下游基因的生物学功能,寻找PP2A/uPAR的下游靶基因。方法:将敲减了 uPAR的PANC-1细胞进行基因芯片分析,然后对差异表达的基因进行GO分析。用Venn分析将uPAR敲减后的差异基因再次与MCM及OA处理后的差异基因三者取交集。用STRING数据库及Cytoscape软件进行下游基因的蛋白网络互作图。用KOBAS及KEGG通路分析网站对下游基因进行通路富集分析。结 果:PP2A/uPAR下游基因所编码的蛋白质之间存在丰富的相互作用关系。这些基因在许多信号通路中富集。该通路最可能的下游靶基因为MMP1、BMP2、IGF2。结论:炎症微环境通过PP2A/uPAR途径促进胰腺癌进展的最可能的下游基因为MMP1、BMP2、IGF2。