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第一部分阿霉素肾病小鼠模型的建立及其体内胆固醇稳态失衡与内质网应激的关系目的:观察阿霉素肾病小鼠血清、肾脏组织和内质网胆固醇水平及内质网应激的情况,了解胆固醇稳态失衡与原发性肾病综合征发生发展的关系。方法:6-8周雄性BALB/c小鼠分为两组:正常对照组(control,CTL)和阿霉素肾病(ADR)组,于第4、8、12周分别处死小鼠。观察小鼠体重变化及活动情况;考马斯亮蓝法检测小鼠24小时尿蛋白水平;光镜和电镜观察肾小球的病理情况;酶法检测肾脏组织所提取内质网总胆固醇水平;酶法检测血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及肌酐水平;荧光定量PCR检测肾脏组织葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78,GRP78)、CCAAT/增强结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)m RNA水平。结果:1.ADR组小鼠活动较正常对照组明显减少,体重下降明显。2.与CTL组相比,ADR组从第2周起出现大量蛋白尿,并逐渐升高,第8周到达高峰,后逐渐下降(P<0.05)。3.与CTL组相比,光镜下第4周ADR组无明显异常,电镜可见明显足突融合、肾小管内可见脂滴;第8周光镜下ADR组可见大量炎症细胞浸润、肾小球硬化,电镜可见广泛足突融合、系膜细胞增生、尿间隙蛋白质沉积、肾小管内溶酶体及脂质增加;第12周光镜下ADR组可见炎症细胞浸润增多、局灶节段性肾小球硬化,电镜可见广泛足突融合甚至足突消失、足细胞凋亡、系膜细胞增生。4.与CTL组相比,ADR组肾脏组织所提取内质网总胆固醇水平从第4周起明显升高(P<0.05)。5.与CTL组相比,ADR组血清总胆固醇水平和甘油三酯水平从第4周起上升;低密度脂蛋白水平在第4周下降,第8周和12周两组之间无明显差异;肌酐水平在第4周无明显差异,从第8周起上升(P<0.05)。6.ADR组肾组织GRP78及CHOP m RNA水平明显高于CTL组,并逐渐升高(P<0.05)。结论:1.阿霉素小鼠肾病模型早期病理表现为微小病变,晚期病理表现为局灶节段性肾小球硬化,并出现肾功能不全。2.阿霉素肾病小鼠出现明显胆固醇稳态失衡,并发生了内质网应激。第二部分NPC1在阿霉素肾病小鼠肾脏组织异常表达目的:观察NPC1在阿霉素肾病小鼠肾脏组织中的表达,了解NPC1和原发性肾病综合征的相关性。方法:6-8周雄性BALB/c小鼠分为两组:正常对照组和阿霉素肾病组,于第4、8、12周分别处死8只小鼠。采用荧光定量PCR和western blot法检测肾组织NPC1的表达;免疫组化和免疫荧光观察NPC1在肾脏中的表达。结果:第4周阿霉素肾病组肾脏组织NPC1 m RNA水平及蛋白水平、肾脏NPC1免疫组化及免疫荧光表达均高于正常对照组;第8周进一步升高达高峰;第12周有所下降(P<0.05)。结论:NPC1可能在阿霉素肾病小鼠肾病的发生发展中起作用。第三部分炎症干扰NPC1介导的胆固醇稳态平衡在足细胞损害中的机制研究目的:观察炎症状态下NPC1在足细胞中的表达,以及干预NPC1对足细胞生理、胆固醇稳态平衡及内质网应激的影响,了解NPC1在炎症介导足细胞损害中的可能作用。方法:小鼠足细胞系MPC5分为对照组(control,CTL组)、高脂组(LDL组)、炎症组(LDL+IL-1β组)和NPC1功能抑制组(U18666A组)四组。采用荧光定量PCR、western blot和免疫荧光检测NPC1在足细胞的表达;流式细胞术AV-PI染色检测足细胞凋亡;荧光定量PCR检测足细胞葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78,GRP78)、CCAAT/增强结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)m RNA水平;酶法检测足细胞内质网胆固醇水平。结果:1.与对照组相比,q PCR、western blot和免疫组化均提示炎症组NPC1表达明显上调(P<0.05);2.与对照组相比,高脂组足细胞凋亡增加,炎症组增加更明显,而抑制NPC1功能可减少足细胞凋亡(P<0.05);3.与对照组相比,高脂组足细胞内质网应激标志蛋白GRP78和凋亡相关蛋白CHOP表达上调,提示足细胞发生了内质网应激并引起了凋亡,而炎症组内质网应激程度更重,但抑制NPC1功能可缓解内质网应激(P<0.05);4.与对照组相比,高脂组内质网胆固醇改变无统计学差异,炎症组内质网胆固醇明显升高,抑制NPC1功能可减少足细胞内质网胆固醇沉积,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:炎症可能通过干扰NPC1而破坏足细胞内胆固醇稳态平衡,促使足细胞发生内质网应激、进而导致足细胞凋亡。第四部分CD36通过激活NLRP3炎症小体介导的足细胞凋亡在原发性肾病综合征中的作用初探目的:观察阿霉素肾病小鼠肾脏组织CD36表达,足细胞CD36表达以及干预CD36对NLRP3炎症小体激活的影响,了解CD36及NLRP3在原发性肾病综合征足细胞损害中的可能作用。方法:6-8周雄性BALB/c小鼠分为两组:正常对照组(control,CTL)和阿霉素肾病(ADR)组,免疫荧光及免疫组化检测小鼠肾脏CD36表达情况。小鼠足细胞系MPC5分为对照组(control,CTL组)、高脂组(LDL组)、炎症组(LDL+IL-1β组)和CD36阻断组(anti-CD36组)四组,荧光定量PCR和western blot检测CD36在足细胞的表达;流式细胞术AV-PI染色检测足细胞凋亡;油红O染色检测足细胞脂质沉积情况;western blot检测足细胞NLRP3蛋白表达;酶法检测足细胞caspase-1活性。结果:1.与CTL组相比,ADR组肾脏CD36表达明显增加(P<0.05)。2.与对照组相比,高脂组CD36表达上调,炎症组上调更明显,而CD36抗体可阻断这一现象(P<0.05)。3.炎症可促进足细胞凋亡,而阻断CD36可降低炎症引起的凋亡(P<0.05);4.与对照组相比,高脂组足细胞脂质沉积增加,炎症组增加更明显,而阻断CD36可减少脂质沉积(P<0.05)。5.炎症可激活足细胞NLRP3炎症小体,而阻断CD36可改善这一现象(P<0.05)。结论:CD36可能通过激活NLRP3炎症小体介导原发性肾病综合征中的足细胞损害。