【摘 要】
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目的:本文旨在研究黄芪甲苷Ⅳ对病毒性心肌炎的保护作用及机制,运用网络药理学方法分析黄芪中具有保护病毒性心肌炎作用的活性成分及作用机制。方法:使用柯萨奇B3(CVB3)病毒和C57BL/6小鼠构建病毒性心肌炎的小鼠模型并使用黄芪甲苷Ⅳ进行干预,每周检测小鼠的体重及死亡情况;实验结束后,体外超声检测小鼠的心脏功能;收集小鼠的外周血并分离血清,利用全自动生化分析仪检测小鼠外周血中心肌损伤标志物LDH和C
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目的:本文旨在研究黄芪甲苷Ⅳ对病毒性心肌炎的保护作用及机制,运用网络药理学方法分析黄芪中具有保护病毒性心肌炎作用的活性成分及作用机制。方法:使用柯萨奇B3(CVB3)病毒和C57BL/6小鼠构建病毒性心肌炎的小鼠模型并使用黄芪甲苷Ⅳ进行干预,每周检测小鼠的体重及死亡情况;实验结束后,体外超声检测小鼠的心脏功能;收集小鼠的外周血并分离血清,利用全自动生化分析仪检测小鼠外周血中心肌损伤标志物LDH和CK-MB水平;分离小鼠的心脏,沿垂直方向将心脏平均分成3段,两端的心肌组织冻存于-80℃冰箱,用于提取RNA和蛋白进行分子生物学检测,中间部分固定于4%的多聚甲醛用于病理学分析;提取心肌组织的总RNA,通过RT-PCR技术检测炎症因子INF-γ和IL-6的表达水平;心肌组织H&E染色和天狼星红染色评价不同干预组小鼠心肌损伤情况和纤维化水平;使用凋亡检测试剂盒检测心肌组织凋亡情况;分离和培养原代心肌细胞并使用黄芪甲苷Ⅳ进行干预,流式细胞仪检测不同干预组的心肌细胞凋亡水平;Western blot检测心肌细胞中凋亡相关因子caspase-3、caspase-6、Fas及Fas L的表达水平以明确黄芪甲苷Ⅳ保护病毒性心肌炎与抑制CVB3诱导的心肌细胞凋亡有关。利用网络药理学手段建立黄芪单体化合物及其干预靶点数据库;利用疾病-靶点数据库检索与VM发生有关的蛋白靶点;在黄芪单体化合物靶点与疾病靶点之间取交集,筛选对VM具有保护作用的黄芪有效成分及干预靶点,利用Cytoscape软件构建“有效成分-靶点-疾病”网络及核心网络;应用Clue GO对靶点进行生物功能及细胞信号通路富集分析,研究黄芪有效成分保护病毒性心肌炎的分子机制。结果:CVB3病毒注射3周,CVB3组有8只小鼠死亡,其死亡率为40%,而CVB3+AST-Ⅳ组有4只小鼠死亡,死亡率为20%,两组间小鼠的死亡风险具有显著性的差异(p<0.05);黄芪甲苷Ⅳ对CVB3诱导的小鼠体重波动具有显著地保护作用;心脏超声结果显示,黄芪甲苷Ⅳ对CVB3诱导的小鼠心脏百分射血分数的降低和E/E’的增加具有显著的保护作用;CVB3组小鼠外周血中心肌损伤标志物LDH和CK-MB水平较Blank组小鼠显著增加,而黄芪甲苷Ⅳ对此有显著地抑制作用。心肌组织H&E染色和天狼星红染色结果显示,黄芪甲苷Ⅳ对CVB3诱导心肌损伤和纤维化具有显著地保护作用;心肌组织TUNEL染色结果显示,CVB3组小鼠心肌细胞凋亡水平较Blank组小鼠显著增加,而黄芪甲苷Ⅳ对CVB3诱导的心肌细胞凋亡具有显著的抑制作用,该结果也在体外细胞实验中得到验证。Western Blot检测不同干预组心肌细胞中凋亡相关因子caspase-3、caspase-6、Fas及Fas L的表达水平,结果显示,黄芪甲苷Ⅳ对CVB3诱导的上述因子在心肌细胞中的表达具有显著地抑制作用;通过网络药理学手段,81种黄芪单体化合物及其1197个干预靶点被纳入到数据库中;在Gene Card、Dis Ge Net及Drug Bank数据库中检索到284个与VM有关的蛋白靶点;两者取交集,共有53个蛋白既是黄芪单体化合物的靶点,又是VM的干预靶点,进一步研究发现,上述53个干预靶点共涉及58种黄芪单体化合物;“黄芪活性化合物-靶点-疾病”核心网络共包含21个靶点和22种黄芪单体化合物,对21个靶点进行功能富集分析,共得到45条生物过程及24条细胞信号通路,其中,22条生物过程和8条细胞信号通路与免疫反应和炎症反应有关,涉及20种黄芪单体化合物。结论:黄芪甲苷Ⅳ能够通过抑制CVB3诱导的心肌细胞凋亡而发挥保护病毒性心肌炎的作用,进一步网络药理学研究发现,黄芪中有20种黄芪单体化合物通过直接或间接作用多条与炎症反应和免疫反应有关的生物过程及细胞信号通路发挥对病毒性心肌炎的保护作用。
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