论文部分内容阅读
目的:(1)通过对宫颈鳞癌和宫颈良性疾病组织、配对血液标本检测,了解血液PD-1、组织PD-L1的表达水平,结合临床资料,评价PD-1、PD-L1与宫颈鳞癌患者预后的关系;(2)以Wistar鼠Hela细胞移植瘤为模型,了解放射治疗对Wistar鼠PD-1、PD-L1、EBI3的影响;(3)通过对Hela细胞系过表达EBI3或抑制EBI3表达,了解与之共培养的T、Treg细胞增殖、凋亡、细胞周期的变化,以及PD-1/PD-L1的变化。方法:(1)收集宫颈鳞癌及宫颈良性病变组织标本各70例,以及配对的外周血鳞癌标本24例,良性病变30例。采用免疫组化法检测组织PD-L1的表达,流式细胞术检测外周血CD4+PD-1+、CD8+PD-1+亚群细胞比例。以上资料与患者的临床病理特征、生存资料做统计分析。(2)对Wistar鼠前肢腋背部接种Hela细胞,建立皮下移植瘤模型,将建模成功的43只大鼠分为放疗组(n=31)和对照组(n=12)。将放疗组给予10Gy 6MeV-电子线一次性放疗。放疗组和对照组分别在放疗前、放疗后1周和放疗后1个月采鼠尾静脉血和肿瘤组织。外周血Ficoll分离后,在流式细胞仪上测CD4、CD8计数。取肿瘤组织用免疫组化法测EBI3、PD-1和PD-L1的表达。(3)通过慢病毒质粒转染的方法建立EBI3过表达和EBI3抑制性Hela细胞系,与Wistar大鼠脾脏来源Treg、T细胞共同培养72小时,使用Western Blot法检测EBI3过表达组、EBI3抑制组、阴性对照组、空白转染组细胞中EBI3、PD-1、PD-L1表达水平。使用MTT法,以光密度值比较各组Treg细胞增殖情况。采用流式细胞术检测Treg、CD4+T、CD8+T细胞的凋亡率,CD4+T和CD8+T细胞占CD3+T细胞比率。结果:(1)两组人群除肿瘤家族史外,发病年龄、结婚年龄、孕产次数、初潮年龄、是否绝经、职业、文化程度、民族方面都没有差别。宫颈鳞癌患者外周血PD-1表达量与组织PD-L1表达呈正相关(R2=0.734,P=0.000;R2=0.66,P=0.000)。宫颈良性病变外周血CD4+PD-1+T细胞、CD8+PD-1+T细胞与相应组织PD-L1的表达相关性不大(R2=0.138,P=0.043;R2=0.174,P=0.022)。血CD8+PD-1+T细胞、组织PD-L1+阳性的细胞数在宫颈肿瘤组与宫颈良性病变组具有统计学差异(p=0.000,p=0.002)。cd8+pd-1表达与是否绝经有统计学差异(卡方=7.152,p=0.012)。肿瘤大小、分化程度、深肌层侵犯、均与外周血pd-1表达程度无关。随肿瘤分期升高,外周pd-1+的cd4+、cd8+细胞百分比也相应升高。随肿瘤直径增大、分期升高,肿瘤组织pd-l1表达量也相应升高。cd4+pd-1+低表达、组织中pd-l1低表达的患者生存期较长。多因素分析结果显示,组织pd-l1表达对患者生存有影响(b=1.844,p=0.019)。(2)wistar鼠经过放疗后,肿瘤直径较治疗前缩小,但是放疗后1月部分肿瘤继续生长。wistar鼠放疗后1月放疗组的cd4、cd8细胞比例较放疗前和放疗后1周明显下降,且明显低于对照组。wistar鼠ebi3、pd-1和pd-l1在放疗前、放疗后1周无显著性差异(p>0.05)。放疗后1月ebi3表达量有明显下降,pd-1和pd-l1有明显增加(p<0.05)。对ebi3、pd-1、pd-l1表达量和t细胞数量进行相关性分析提示,ebi3与cd4+、cd8+细胞数量呈正相关(r=0.723,p<0.001;r=0.413,p=0.021)。相反,pd-1表达量与cd4+、cd8+细胞数量呈负相关(r=-0.631,p<0.001;r=-0.509,p=0.004)。pd-l1表达量也与cd4+、cd8+细胞数量呈负相关(r=-0.606,p<0.001;r=-0.560,p=0.001)。(3)hela细胞系试验表明,ebi3过表达组ebi3表达升高,pd-1、pd-l1表达下调(p<0.05),ebi3抑制组ebi3表达下降,pd-1、pd-l1表达上升。空白转染组和阴性对照组两组间的pd-1、pd-l1表达水平无显著差异(p>0.05)。ebi3过表达组treg细胞的od值升高(0.43±0.05),ebi3抑制组treg的od值降低(0.31±0.02)(p<0.05)。空白转染组和阴性对照组无差异(p>0.05)。ebi3过表达组、ebi3抑制组、阴性对照组、空白转染组四组在细胞周期方面没有明显差异(p>0.05),ebi3过表达组treg、cd4+t、cd8+t细胞凋亡率下降(均p<0.05),ebi3抑制组treg、cd4+t、cd8+t细胞凋亡率升高(p均<0.05),相同组内cd4+t的凋亡低于cd8+t(p均<0.05),四组之间cd4/cd8没有明显差别(p>0.05)。结论:(1)宫颈鳞癌患者外周血cd4+pd-1+t细胞、组织pd-l1+阳性的细胞增多,且与肿瘤的分级、预后有关,组织pd-l1表达是患者的独立预后因素。(2)放疗能使wistar鼠hela细胞移植肿瘤缩小,提示hela细胞移植瘤对放疗敏感。cd4、cd8细胞的比例在放疗后1月明显下降,提示t细胞在放疗后受到抑制。放疗后1月pd-1和pd-l1表达增加,提示放疗可能造成肿瘤局部微环境免疫抑制状态。放疗后1月ebi3表达下降,提示放疗对ebi3表达有影响。(3)过表达ebi3,使pd-1、pd-l1表达下降,treg凋亡下降,t细胞凋亡下降,反之成立。提示ebi3负向调控pd-1、pd-l1表达,负向调控treg凋亡及t细胞凋亡。通过对hela细胞调高或降低ebi3表达,发现treg细胞周期没有影响,t细胞cd4/cd8比例也没有影响,提示ebi3的功能不包含调控treg细胞周期或cd4/cd8细胞比例。(4)放射治疗通过降低宫颈癌细胞ebi3表达,上调pd-1/pd-l1通路,下调t细胞水平,产生不利的免疫影响;过表达ebi3,可以抑制PD-1、PD-L1表达,减少T细胞凋亡,减弱放疗引起的免疫抑制状态。