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目的:大量研究结果显示小胶质细胞的激活与新生儿缺氧缺血有关,受损脑组织内小胶质细胞存在经典激活(M1)和替代激活(M2)两种表型,分别发挥促炎和抗炎、修复功能。在缺氧的早期,小胶质细胞迅速激活,表现为M1型,约24小时后转为M2型。从分子水平分析HIE中小胶质细胞活化的相关机制,可为此类患儿的治疗提供新的靶点。研究显示TSPO在静息小胶质细胞中的表达很低,当小胶质细胞因神经系统受损而出现活化时,TSPO水平经检测呈现明显升高,表明小胶质的激活与TSPO的表达可能存在一定的联系。另有研究显示PPARγ通路的激活还可参与血肿的清除及神经功能的保护。因此本课题组通过体内、体外实验来探讨外周型苯二氮?受体转运蛋白(TSPO)是否介导PPARγ通路来调节小胶质细胞向M2型极化,从而为新生儿缺血、缺氧的治疗寻找新的靶点。方法:(1)体内实验:本次实验我们选择Rice-Vannucci法来建立新生Wistar大鼠缺血缺氧模型,将处理后的大鼠分成四组:(1)A组(假手术组,n=20);(2)B组(模型组,n=20);(3)C组(模型+PBS注射组,n=20);(4)D组[模型+Atriol(TSPO抑制剂)注射组,n=20]。各组大鼠造模后第3天后分两批处死,分别进行灌注取脑(用于免疫荧光分析)和断头取脑(用于蛋白检测)。对各组大鼠脑组织行尼氏染色检查,并检测大鼠脑组织含水量、伊文思蓝(EB)含量。通过Western blot法来检测造模后第3天不同组中PPARγ通路蛋白和凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2及Caspase-3蛋白的表达情况。选择免疫荧光染色法对脑组织中Iba-1+CD16/32、Neu N+caspase-3及Iba-1+CD206的共定位表达情况进行检测。(2)体外实验:分离BALB/c小鼠原代小胶质细胞,将上述培养处于对数生长期的原代小胶质细胞按照1×10~4的细胞数接种于48孔板内,并选择20ng/ml的r IL-4对小胶质细胞分别处理0,6,12,以及24小时。将细胞分成五组:(1)Control组:为正常培养的小胶质细胞;(2)IL-4组:为经过20ng/ml的r IL-4诱导小胶质细胞极化M2表型模型;(3)IL-4+Atriol组:为经过r IL-4诱导小胶质细胞极化M2表型模型加Atriol(50μM)处理;(4)IL-4+FGIN-1-27组:为经过r IL-4诱导小胶质细胞极化M2表型模型加FGIN-1-27(1μM)处理;(5)IL-4+HA-TSPO组:取转染处理后的小胶质细胞使用r IL-4进行诱导处理。将5组细胞置于37℃的细胞培养箱内继续培养12h。利用Western blot法检测各组TSPO、PPARγ蛋白的表达情况;通过实时定量PCR法检测各组TSPO、PPARγm RNA及M2极化型小胶质细胞标志物CD206、Arg-1、YM-1和FIZZ-1的表达情况;使用Elisa法检测各组中BDNF、CNTF-1、IGF-1和NGF-1细胞因子的表达水平。结果:1.体内实验:(1)造模后第3天B、C组大鼠的损伤侧可见明显的水肿,而D组大鼠的损伤侧水肿情况较B、C组大鼠显著减轻。经过统计分析,B、C及D组大鼠损伤侧脑含水量相较于A组大鼠显著升高;同时相较于B、C组大鼠,D组大鼠损伤侧脑含水量著降低(P<0.05)。同时B、C及D组大鼠损伤侧EB的含量相较于A组显著升高;而相较于B、C组大鼠,D组大鼠损伤侧的EB的含量显著降低(P<0.05)。Nissl染色结果则显示A组大鼠的海马区及大脑皮层的细胞整齐排列,具有正常的结构,而B、C、D组的上述细胞则可见结构出现紊乱,经统计分析3组细胞的丢失量显著高于A组大鼠(P<0.05)。然而D组大鼠右侧脑组织的细胞坏死及变性程度相较于B、C组大鼠显著减轻,且D组大鼠细胞的丢失量显著低于B、C组大鼠(P<0.05)。(2)相较于A组大鼠,B组、C组和D组大鼠脑组织中Neu N+Caspase-3荧光蛋白表达共定位的阳性细胞数表达水平显著增加,同时B组、C组大鼠脑组织中Neu N+Caspase-3荧光蛋白表达共定位的阳性细胞数表达水平显著高于D组大鼠(P<0.05)。A组大鼠的神经元基本未出现凋亡,而B组、C组和D组大鼠脑组织中Caspase-3、Bax蛋白的表达水平显著升高,Bcl-2蛋白的表达水平显著下降;同时B组、C组大鼠脑组织中caspase-3、Bax蛋白的表达水平相较于D组显著升高,Bcl-2蛋白的表达水平较于D组显著下降,差异均存在统计学意义(P<0.05)。(3)B组、C组新生Wistar大鼠脑组织在造模后的第3天,Iba-1+CD206及Iba-1+CD16/32荧光蛋白共定位阳性细胞的水平经对比无明显差异(P>0.05);但B组、C组和D组新生Wistar大鼠脑组织Iba-1+CD206及Iba-1+CD16/32荧光蛋白共定位阳性细胞的水平显著高于A组(P<0.05);同时B组、C组中荧光蛋白表达共位阳性细胞中Iba-1+CD16/32细胞的水平相较于Iba-1+CD206细胞显著升高;但在D组中,荧光蛋白表达共位阳性细胞中Iba-1+CD16/32细胞的水平相较于Iba-1+CD206细胞显著降低(P<0.05)。(4)B、C及D组大鼠脑组织中PPARγ蛋白的表达水平相较于A组均显著降低(P<0.05),而TSPO蛋白的表达水平则显著升高(P<0.05);同时D组大鼠脑组织中PPARγ蛋白的表达水平相较于B、C组显著升高(P<0.05),而TSPO蛋白的表达水平则显著降低(P<0.05)。2.体外实验:(1)小胶质细胞在镜下主要呈现长梭形、圆形及阿米巴样,该细胞贴壁生长。为了对小胶质细胞的纯度进行检测,我们对其进行DAPI和Lectin荧光双标,检测结果显示我们获取的小胶质细胞纯度已超过96%。(2)将纯化后的小胶质细胞使用20ng/ml的r IL-4分别诱导0、6、12和24小时,检测TSPO和PPARγ蛋白及m RNA在小胶质细胞中的表达水平。Western blot结果表明,在r IL-4诱导6、12小时后,TSPO蛋白的表达逐渐降低,诱导24小时后略有恢复。r IL-4诱导后PPARγ蛋白表达水平显著升高,其最高表达水平在诱导12小时后。同时TSPO和PPARγ的m RNA表达水平变化与两者的蛋白表达水平一致。(3)为了进一步研究TSPO在极化为M2表型小胶质细胞中的功能,用不同TSPO配体处理小胶质细胞12小时,并测定PPARγ的表达水平。结果显示活化的PPARγ定位于细胞核并引起靶基因的激活或抑制。在免疫印迹实验前提取小胶质细胞的核蛋白和胞质蛋白,分析PPARγ蛋白在细胞质和细胞核中的表达水平。结果显示TSPO拮抗剂Atriol增强了极化为M2表型小胶质细胞中PPARγ蛋白的表达,而TSPO激动剂FGIN-1-27则抑制了PPARγ蛋白在细胞质和细胞核中的表达。TSPO在小胶质细胞中的过度表达可显著抑制r IL-4诱导后小胶质细胞细胞质和细胞核中PPARγ蛋白的表达。提示极化为M2表型小胶质细胞中PPARγ的表达和激活受到TSPO的调控。(4)为了确定r IL-4诱导的小胶质细胞M2极化是否受TSPO的调节,我们通过实时PCR方法检测TSPO干预后极化为M2表型小胶质细胞标志物的表达。与对照组相比,r IL-4明显增加小胶质细胞中CD206、Arg-1、YM-1和FIZZ-1基因的表达,表明小胶质细胞呈M2表型极化。同时TSPO拮抗剂Atriol增强了r IL-4诱导的小胶质细胞中CD206、Arg-1、YM-1和FIZZ-1基因的表达。与r IL-4诱导组相比,TSPO激动剂FGIN-1-27和TSPO过表组上述基因的表达显著降低。提示TSPO是参与小胶质细胞M2极化的重要调节因子。(5)我们使用TSPO配体对培养的小胶质细胞进行干预,检测培养液中脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子1(CNTF-1)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)和神经生长因子1(NGF-1)的表达水平。与对照组相比,r IL-4可诱导小胶质细胞释放BDNF、CNTF-1、IGF-1和NGF-1;PK11195同样可增强BDNF、CNTF-1、IGF-1和NGF-1的表达水平,FGIN-1-27和TSPO过度表达组上述细胞因子的表达水平受到明显抑制。提示TSPO通路可能参与调控了小胶质细胞的促营养能力。结论:TSPO可能通过介导PPARγ通路调控新生大鼠缺氧、缺血后M2表型小胶质细胞的极化而对受损神经发挥保护作用。