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背景放射性脑水肿是放疗的严重副作用。虽然放射性脑水肿的病因很多,但发病机制尚不清楚,临床治疗也不理想。目前的证据表明,脑微血管内皮细胞（BMECs）对辐射高度敏感,可能在放射性脑水肿中发挥重要作用。脑微血管内皮细胞凋亡可导致毛细血管结构异常和血脑屏障解体等损伤。因此,了解脑放疗后BMECs转录组的差异表达可能有助于阐明放射性脑水肿的发病机制。目的1. 探究脑微血管内皮细胞转录表达谱在X射线照射后的改变2.探究脑微血管内皮细胞钙库操纵钙内流在X射线照射后的变化方法1. 脑微血管内皮细胞原代培养将20g左右的SD大鼠CO2窒息处死后,75%酒精消毒刷洗,快速剪开颅骨,剥离硬脑膜和软脑膜,去除大血管,收集大脑皮质。将皮质剪碎匀浆,通过80目滤网快速过滤。过滤物通过200目滤网收集上层过滤物。过滤物加入0.2%II型胶原酶,37℃消化25分钟后用无菌PBS冲洗3次接种到细胞培养板中,48小时后换液。待细胞长至80%密度时传代培养。2. X射线照射将原代培养的脑微血管内皮细胞分为3组,分别是低剂量照射组（5Gy）、高剂量照射组（20Gy）和对照组。照射组接受5Gy或者20Gy单次剂量照射而对照组除了不接受X射线照射,其余处理与对照组相同。3. 高通量测序和生信分析根据高剂量组和低剂量组在照射后12h和24h两个时间点进一步分组,加上对照组,一共5组,即:5Gy照射后12h组、5Gy照射后24h组、20Gy照射后12h组、20Gy照射后24h组以及对照组。每组设置3个生物学重复。提取完5组细胞RNA后,通过c DNA文库构建、上机测序获得5组脑微血管内皮细胞转录本。将4 组照射组分别与对照组比较,差异倍数（FC）取大于或等于1.5,P值小于0.05,对转录本进行差异分析获得差异表达基因,并对差异表达基因进行深层次的生物信息学分析。4. 实时荧光定量PCR（q PCR）利用上述提取的5组脑微血管内皮细胞RNA,通过逆转录,q PCR实验得到相对定量的m RNA表达量。5. 钙成像同样,观察上述5组原代脑微血管内皮细胞钙库操纵钙内流的变化情况。在无钙缓冲液（0PSS）中加入毒胡萝卜素（TG）使细胞内钙库清空,通过在缓冲液中加入Ca2+观察对照组和实验组在钙库清空的前提下外钙内流的差异情况。结果1.与对照组相比,照射组共筛选出40个差异表达基因,分别是:Zfp263、Zfp217、Tp53Inp1、Tfap2B、Tap1、Svop、Sgk1、Rf00560、Rf00026、Rac1、Rab40C、Puf60、Psrc1、Plk2、Pla2G16、Orai2、Nr4A1、Lpl、Loc100912596、Lbh、Klhl20、Kin、Hmox1、Hint3、Glrx3、Gdf6、Gdf15、Fzd7、Fos、Fas、Egr2、Edn1、Cyp2T1、Cebpd、Ccdc117、Calhm2、Bok、Atp5Pb、Aco2、Ackr3。这些差异表达的基因与细胞周期、凋亡、血管通透性和钙离子信号调节等生物学过程有关。2.40个差异表达基因中,照射组Orai2的表达量比对照组显著增高,且随着时间的推移表达量升高。3.实时荧光定量PCR显示5 Gy和20 Gy照射组Orai2的RNA表达量比对照组显著增高,且随着时间推移表达量逐渐升高,这与测序结果一致。4.在原代培养的脑微血管内皮细胞钙库耗竭的前提下,胞外给予钙离子,照射组外钙内流的程度明显强于对照组。结论1.X射线照射后的脑微血管内皮细胞Orai2表达量明显升高,Orai2上调可能是导致放射性脑水肿的重要原因。2.X射线照射后的脑微血管内皮细胞钙库操纵钙内流增强,钙库操纵钙内流增强可能是诱发放射性脑水肿的机制之一。