由旋毛虫引起的旋毛虫病是一种呈全球性分布的食源性人兽共患寄生虫病,主要是通过食用含有旋毛虫感染性幼虫的生的或者不熟的肉类所导致的。近年来在我国周边国家如韩国、泰国、老挝、越南等国也已发生了多次人体旋毛虫病暴发,因此,旋毛虫病作为了一种新现和再现的人兽共患疾病,对人体健康、社会、经济均造成了巨大的影响。目前,国内外对旋毛虫病的诊断主要集中在肌肉幼虫阶段的旋毛虫抗原。国际旋毛虫病委员会(ICT)建议旋毛虫肌幼虫ES抗原可作为诊断旋毛虫的金标准。然而,当旋毛虫肌幼虫ES抗原用于检测旋毛虫感染小鼠或猪的血清时,抗旋毛虫抗体IgG直到感染后3-4周才能检测到阳性;并且感染旋毛虫的病人在感染28天以后抗旋毛虫的抗体阳性率才能达到100%。因此,在旋毛虫感染后存在有2~3周的“窗口期”(window phase)。在旋毛虫的生活史中,肠道感染性幼虫(IIL)和成虫是旋毛虫对宿主肠黏膜的侵入期,其ES蛋白最早与肠黏膜直接接触并相互作用,能够接触宿主的免疫系统首先引起宿主的免疫应答;因此,IIL和成虫的排泄分泌抗原含有刺激宿主产生早期免疫应答的主要成分。在旋毛虫感染后的早期,最早出现的抗旋毛虫抗体也是针对这些抗原的。由于旋毛虫感染宿主后4周才发育为成囊期幼虫(肌幼虫)且被包裹在胶原囊中,肌幼虫接触宿主的免疫系统比较晚,因此宿主产生的抗肌幼虫抗体也比较晚。所以,现在迫切的需要从旋毛虫肠道期虫体中鉴定和筛选特异性的早期诊断抗原。本研究运用血清学诊断的方法检测旋毛虫成虫ES抗原对旋毛虫病的早期诊断价值,从成虫ES蛋白中筛选出旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶(Trichinella spiralis putative serine protease,TsSP)进行克隆表达和功能鉴定,同时检测rTsSP对旋毛虫感染的早期诊断及疫苗靶标的潜在应用价值。材料方法1旋毛虫、实验动物、血清、菌种及细胞系不同种旋毛虫在本实验室传代保种备用。整个实验所用的动物均购买于实验动物中心。血清:旋毛虫不同种属、弓形虫、裂头蚴、日本血吸虫和广州管圆线虫感染小鼠血清,以及其他寄生虫感染病人血清。细胞系:IEC,C2C12,于本实验室液氮中冻存。载体和菌种:克隆载体pGEM-T,表达载体pQE-80L,宿主菌为BL21,为本实验室冻存。2旋毛虫成虫ES抗原的早期诊断价值评估AW ES-ELISA诊断旋毛虫病的敏感性和特异性。准备30只雌性BALB/c小鼠,感染不同剂量的旋毛虫(100条/只和500条/只)。AW ES-ELISA检测旋毛虫早期和轻度感染小鼠血清的敏感性。最后AW ES-ELISA检测旋毛虫感染早期及晚期病人血清及其他寄生虫病人血清,进一步评估AW ES对旋毛虫病早期诊断价值的敏感性和特异性。3旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶(TsSP)生物信息学分析,克隆表达及鉴定将早期感染血清识别的成虫ES蛋白进行质谱分析后,从被鉴定的蛋白中挑选出了具有潜在早期诊断价值的旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶(Trichinella spiralis putative serine protease,TsSP)。应用NCBI,ExPasy,SignalP3.0serve及TMHMM Server v.2.0等在线软件分析预测了TsSP的结构域、理化性质、信号肽与跨膜结构域;在大肠杆菌中克隆表达并纯化,将纯化后的rTsSP皮下接种免疫小鼠,获得rTsSP免疫血清,Western-blot检测rTsSP的免疫原性及抗原性;通过RT-PCR和q-PCR检测TsSP基因在旋毛虫不同发育虫期是否转录及转录水平的高低;通过间接免疫荧光(IFA)检测TsSP在不同发育虫期虫体表面及内部的表达;对不同虫期虫体进行石蜡包埋及冰冻组织切片,通过IFA观察TsSP在不同时期虫体的具体定位;制备不同虫期的可溶性蛋白,通过ELISA和Western blot,检测TsSP蛋白在不同虫期是否表达及表达量的高低。4 TsSP与宿主肠上皮细胞的特异性结合及其功能鉴定通过Far-Western、ELISA及IFT分析了rTsSP与小鼠肠上皮细胞(IEC)的特异性结合作用。将不同稀释度的抗rTsSP血清、感染血清及正常血清分别与肠道感染性幼虫(IIL)混合后,分别接种到IEC单层中体外孵育2h进行幼虫体外侵入实验,镜下观察不同血清对IIL侵入IEC的抑制作用。通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)检测抗rTsSP血清对虫体的杀伤作用,镜下观察幼虫的活性和巨噬细胞粘附情况,并计算幼虫死亡率,并将抗rTsSP抗体依赖的ADCC作用后的ML经口感染小鼠,计算ADCC作用后肌幼虫的感染率。5 rTsSP对旋毛虫病的早期诊断按重度(500条/只)、中度(300条/只)及轻度(100条/只)3个剂量,将不同剂量的旋毛虫感染小鼠,每组各10只,感染后开始隔天采血,rTsSP-ELISA检测rTsSP对旋毛虫早期感染血清的识别、检测rTsSP对旋毛虫感染小鼠血清的敏感性与特异性。同时检测旋毛虫感染猪血清,旋毛虫感染早期及晚期病人血清及其他寄生虫病人血清,进一步评估rTsSP对旋毛虫病的早期诊断的潜在应用价值。6 rTsSP在免疫保护中的应用为了评估rTsSP的免疫保护作用,每只小鼠皮下免疫20μg rTsSP,隔10天免疫1次,共免疫3次,检测免疫后抗rTsSP抗体水平及所诱导的体液免疫应答,并计算成虫和肌幼虫的减虫率;并用霍乱毒素亚单位(CTB)作为佐剂,通过滴鼻途径对小鼠接种rTsSP。间隔10d免疫1次,共免疫3次,分别检测滴鼻免疫后肠道内总的和特异性sIgA水平;肠道分泌sIgA细胞及杯状细胞的数量;检测脾细胞和肠系膜淋巴结诱导的细胞因子水平的变化;计算感染后收集不同天数成虫和肌幼虫的减虫率。7统计学分析用SPSS17.0分析软件和Graphpad Prism对所有结果和数据进行统计学分析及图表绘制,采用单因素方差分析,重复资料方差分析,t检验和卡方检验进行统计分析,检验水平α=0.05。结果1.成虫ES抗原的早期诊断应用成虫ES-ELISA检测感染旋毛虫不同剂量后不同天数的小鼠血清,结果表明,成虫ES抗原与粗抗原和肌幼虫ES在检测感染100条旋毛虫感染血清时,分别在感染后8、12及12天检测到抗旋毛虫抗体IgG,在检测高剂量组(500/条)时分别在10,8,10天检测到抗旋毛虫抗体。用这3种抗原分别检测旋毛虫早期和晚期病人血清结果表明,成虫ES的敏感性和特异性分别是100%和97.48%。2.TsSP生物信息学分析预测TsSP基因(GI:164521948)序列全长为1372bp,编码429个氨基酸残基,其分子质量为47.55kDa,等电点为8.73;不稳定指数为42.25,脂肪指数为71.52,总的平均亲水性是-0.360,认为该蛋白为亲水性蛋白。该蛋白N端具有明显的疏水性区域,无跨膜区。预测TsSP为分泌型蛋白,存在信号肽,切割位点在18-19位氨基酸残基之间,表明成熟的肽段始于第19位氨基酸,具有信号肽SP序列,认为其能够分泌到细胞外。该蛋白在第37-277位之间是个高度保守的结构功能域Tryp-SPC。I-TASSER预测TsSP属于丝氨酸蛋白酶家族。3.TsSP的克隆表达及鉴定设计PCR外引物和具有特异性酶切位点的内引物,通过巢式PCR扩增出大小为1236bp的TsSP基因,将TsSP基因连接到克隆载体pGEM-T中,双酶切后将TsSP基因再连接到表达载体pQE-80L上构建重组表达质粒,转染E.coli BL21感受态细胞。双酶切鉴定重组质粒构建成功。对连接成功的单菌落加入IPTG诱导表达,收集菌体进行SDS-PAGE,发现在45.2kDa处出现一条明显条带,而未经诱导的细菌未见此条带,表明TsSP重组蛋白表达成功。Western blot分析显示,rTsSP蛋白能被旋毛虫感染小鼠血清和抗rTsSP血清识别,表明rTsSP具有良好的免疫原性和抗原性。RT-PCR和qPCR结果表明TsSP基因在旋毛虫不同发育虫期(ML,IIL,3dAW,6dAW和NBL)均转录,并且各个发育期转录水平没有差异(P>0.05)。Western blot和ELISA结果表明TsSP在旋毛虫的各个虫期均表达,并且在IIL和NBL表达水平相对较高;IFA结果显示,TsSP在以上5个虫期均表达,并且主要定位在虫体的表皮,杆状体和胚胎部位。4.TsSP与宿主肠上皮细胞的特异性结合及其功能鉴定4.1 rTsSP与肠上皮细胞结合的特异性分别通过Far-Western、ELISA及IFT分析了rTsSP与小鼠肠上皮细胞(IEC)的特异性结合作用,Far-Western结果显示抗rTsSP免疫血清识别了24条蛋白带,分子量为14.4kDa~86.5kDa,而rTsSP不能与C2C12蛋白结合,表明rTsSP能与IEC蛋白特异性结合。ELISA检测亦发现rTsSP能与IEC蛋白结合且具剂量依赖性。IFT发现rTsSP可与IEC和肠粘膜特异性结合;共聚焦显微镜检查结果表明rTsSP与IEC的结合部位是细胞膜与细胞质。4.2抗rTsSP抗体对幼虫侵入IEC的抑制或阻断作用体外侵入实验结果表明,在相同血清稀释度(1:50)时,抗rTsSP血清、感染血清及正常血清组的幼虫侵入率分别为31.48%,15.84%及84.16%(P<0.01),且抗rTsSP抗体对幼虫的侵入作用具有抗体剂量依赖性,随血清稀释度的增加而降低(P<0.01),表明抗rTsSP抗体对幼虫侵入IEC具有明显的抑制作用。4.3抗rTsSP抗体依赖的ADCC对旋毛虫幼虫的杀伤作用将抗rTsSP血清、感染血清及正常血清分别与新生幼虫(NBL)和肌幼虫(ML)共孵育,再分别加入小鼠腹腔巨噬细胞孵育不同时间后,镜下观察幼虫的活性和巨噬细胞粘附情况,并计算幼虫死亡率。结果显示当血清稀释度为1:100时,抗rTsSP血清能促进巨噬细胞对NBL和ML的粘附。抗rTsSP血清对NBL和ML的细胞毒性分别为52%与44.67%,明显高于正常血清的21.33%和18%(P<0.01);细胞毒性具有抗体剂量依赖性,且随孵育时间的延长而增加(P<0.01)。结果表明抗rTsSP抗体依赖的ADCC在体外对NBL和ML具有特异性杀伤作用。将抗rTsSP抗体依赖的ADCC作用后的100条ML经口感染小鼠,与正常血清组相比,感染后3d与42d的成虫与肌幼虫减率分别为89.4%和36.50%,表明抗rTsSP抗体可通过ADCC方式杀伤ML,并可明显降低ML的感染性及其在肠道中的发育。5.rTsSP的诊断价值在旋毛虫重度、中度和轻度感染小鼠,rTsSP-ELISA分别在感染后8、7及7天检测到抗rTsSP抗体,并且在感染后16、10及10天抗体检测阳性率达到100%;rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染小鼠的敏感性与特异性均为100%。rTsSP-ELISA诊断早期和晚期旋毛虫病人时的敏感性分别为95.24%和100%,对于早期旋毛虫病人诊断的敏感性明显高于肌幼虫ES诊断的敏感性(75%,P<0.05);rTsSP-ELISA诊断旋毛虫病人的特异性(99.49%)明显高于ES-ELISA的特异性(91.41%)(P<0.05)。6.rTsSP的免疫保护6.1皮下接种rTsSP诱导的免疫第1次与第2次免疫后血清中rTsSP特异性抗体IgG水平明显升高,末次免疫后10d抗rTsSP抗体IgG效价为1:10~5;免疫后10、20、30及40d,IgG1水平明显高于IgG2a(P<0.01),表明rTsSP免疫小鼠诱导了Th2型为主的体液免疫应答。与PBS组相比,rTsSP免疫组和佐剂对照组在攻击感染后5d的成虫减虫率分别是52.70%和10.30%(P<0.05);感染后42d,rTsSP免疫组和佐剂对照组的肌幼虫减虫率分别是52.1%和3.66%(P<0.05)。结果表明,rTsSP皮下免疫小鼠可诱导明显的免疫保护。6.2经鼻接种rTsSP诱导的免疫保护用rTsSP经鼻免疫小鼠可引起明显的肠道总sIgA及TsSP特异性sIgA水平升高;血清TsSP特异性抗体IgG/IgM/IgA水平亦明显升高;在免疫接种小鼠的十二指肠中能检测到更多的杯状细胞/酸性粘蛋白和IgA分泌细胞。与对照组相比,rTsSP免疫组的IFN-γ,IL-4和IL-10水平显著增加。末次免疫后10d用300条幼虫攻击感染,与PBS对照组相比,感染后3、5、7、9d的成虫减虫率分别是49.95%、61.30%、68.30%及71.10%(P<0.001);感染42d免疫组和佐剂组的肌幼虫减虫率分别是62.1%及13.9%(P<0.001)。结果表明,rTsSP经鼻免疫小鼠后诱导了明显的肠道sIgA应答及全身的Th1/Th2混合型免疫应答,并对旋毛虫攻击感染产生了明显的保护效果。结论1.旋毛虫成虫ES抗原对旋毛虫病早期诊断具有较高的敏感性和特异性,为旋毛虫病的早期诊断提供一个新的诊断抗原来源;2.克隆表达了旋毛虫TsSP,TsSP在旋毛虫的各个虫期均有转录和表达,主要定位在虫体的表皮,杆状体和胚胎;3.rTsSP蛋白能够与肠上皮细胞特异性结合,抗rTsSP抗体能够抑制旋毛虫体外侵入肠上皮细胞,抗rTsSP抗体能够介导巨噬细胞对NBL和ML的杀伤作用。TsSP可能是旋毛虫对IEC的主要侵入蛋白;4.rTsSP-ELISA诊断旋毛虫病具有较高的敏感性和特异性,可作为旋毛虫病潜在的早期诊断抗原;5.rTsSP蛋白皮下/经鼻免疫小鼠后,诱导了局部粘膜和全身的Th1/Th2混合型免疫应答,并对旋毛虫攻击感染产生了明显的保护效果。