精液的冷冻保存是加快新品种选育以及保护优良种畜资源的重要手段。但是冻后精子受精能力严重受损且个体差异极大是冷冻精液生产面临的共性问题。褪黑素具有很强的抗氧化作用,通过清除精子细胞内过量的活性氧,实现提高冻后精子质量。本论文通过对冷冻前、冷冻后以及添加褪黑素冷冻后精子样品进行同步的蛋白质组学以及磷酸化蛋白质组学研究,探讨精子冷冻损伤的分子机制以及褪黑素在精子冷冻中发挥作用的分子机制。本论文系统地研究了不同样品制备方法对牛精子蛋白质组学研究的影响。以安格斯牛冷冻精子为实验材料,用5种不同的裂解液提取精子蛋白质后分别用3种不同的酶解方式获得多肽段,通过LC-MS/MS系统采用同样的方法获得质谱数据。实验结果显示:牛精子蛋白质提取能力BS最强,BU最弱;BT、BR以及BD相当。但是BS-FASP不适用于牛精子蛋白质组学研究。通过胶内酶解鉴定到的蛋白质均多于FASP法,但是胶内酶解操作过程复杂繁琐,耗时长。基于BD的溶液内酶解法鉴定到的蛋白质数量最多,膜蛋白提取鉴定能力较强,且操作时间最短,是较为理想的样品制备方法。通过蛋白质组学技术分别对冷冻前、冷冻后、添加褪黑素冷冻后蒙古牛和鲁西牛精子样品进行蛋白质组学以及磷酸化蛋白质组学研究,结果显示精液的冷冻-解冻过程严重影响了精子线粒体氧化磷酸化过程,线粒体内膜呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ部分蛋白、线粒体膜孔道蛋白VDAC2、PPIF,以及Cytochrome C表达量都增加,而线粒体膜孔道的变化使得Cytochrome C从线粒体内膜释放到细胞质,引起凋亡。适当浓度褪黑素(10~-66 M)的添加使以上蛋白的变化程度减小,使精子受到的冷冻损伤降低;但是高浓度的褪黑素(10~-33 M)会损伤精子活力。研究中发现热休克蛋白HSP90B1在冻融后精子中表达量下降,添加10~-66 M褪黑素后其下降程度减小,但添加10~-33 M褪黑素后HSP90B1大幅度下降,与精子活力活力数据相一致,说明褪黑素对冷冻精子的保护作用可能与HSP90B1蛋白有关。磷酸化蛋白质组学研究结果显示:精液的冷冻-解冻使精子蛋白质的磷酸化水平显著升高。这些磷酸化变化的蛋白KEGG主要富集到糖酵解/糖异生能量通路,蛋白质磷酸化修饰在精子应激调控中发挥着重要作用。合适浓度褪黑素的添加可以有效地抑制冷冻-解冻过程中精子蛋白质磷酸化修饰的改变。精子蛋白质组学研究结果显示:蒙古牛鉴定到的蛋白质数多于鲁西牛,差异蛋白主要是顶体囊泡相关蛋白。冷冻前与冷冻后精子差异蛋白质数以及磷酸化肽段数鲁西牛显著高于蒙古牛,从分子层面证实蒙古牛精子冷冻损伤率更低。差异磷酸化肽段的motif富集结果显示:对于鲁西牛冷冻后与冷冻前精子差异磷酸化肽段富集到的motif主要有4个,添加褪黑素冷冻后与冷冻前精子差异磷酸化肽段富集到的motif减少为1个且与蒙古牛冷冻后与冷冻前差异磷酸化肽段motif富集结果相似。因此褪黑素在精子冷冻中的作用机制可能是通过改变激酶的活性降低了冷冻过程中蛋白质磷酸化修饰的改变,从而降低了精子的冷冻损伤。