乳中最为重要的是乳蛋白和乳脂肪的含量以及组成,但我国牛奶中乳蛋白和乳脂肪的含量较低,寻找调控乳蛋白、乳脂肪关键信号分子为提高奶牛乳品质提供重要的实验依据。METTL3(methyltransferase-like protein 3)也称m~6A甲基转移酶,能够催化mRNA生成m~6A。大量研究表明METTL3通过调控mRNA中m~6A甲基化水平,进而对细胞中蛋白质的合成起到重要的调节作用。实验室前期结果表明,METTL3通过调节mTOR和SREBP-1c基因的表达,从而影响BMECs中乳蛋白、乳脂肪的表达。本实验拟研究METTL3促进mTOR和SREBP-1c基因的表达和分子机制,以及p-GlyRS作用于METTL3的分子机制。甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)具有非经典功能,通过蛋白质免疫共沉淀质谱分析表明,GlyRS在胞核中以p-GlyRS的形式与其下游蛋白METTL3结合,实验室前期研究表明p-GlyRS可能具有激酶活性,p-GlyRS可能使METTL3磷酸化。从而激活METTL3,本研究揭示METTL3调控BMECs中乳蛋白、乳脂肪的分子机制以及p-GlyRS调控METTL3的分子机理。组织块法获取奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs),利用免疫荧光法及Western blotting(WB)检测BMECs中CK18(Cytokeratin 18)和β-酪蛋白(β-casein)的表达,对METTL3基因进行过表达、干扰,WB实验检测BMECs中β-casein的表达情况,同时利用甘油三酯试剂盒检测BMECs中甘油三酯的表达。通过Dot blot实验检测BMECs中mRNA m~6A的表达情况。RIP实验检测METTL3靶蛋白mTOR和SREBP-1c的mRNA m~6A表达情况。FRET实验,分析两蛋白之间的相互作用。通过激光共聚焦共定位实验,分析添加蛋氨酸和雌激素后p-GlyRS与METTL3相互作用有何变化。通过体外激酶实验检测p-GlyRS能否激活GST-METTL3。实验结果表明获得了具有泌乳功能的奶牛乳腺上皮细胞。METTL3过表达后,β-casein的表达量增加同时细胞内脂滴数量明显增多,脂滴体积变大,细胞中TAG合成量增加。而当METTL3抑制时,β-casein的表达量降低同时细胞内脂滴数量减少,脂滴体积变小,细胞中TAG合成量降低。RIP实验结果表明METTL3过表达、干扰后BMECs中mTOR和SREBP-1c的mRNA m~6A表达增多、减少。FRET结果表明p-GlyRS与METTL3的FRET值大于20%,激光共定位实验表明,添加蛋氨酸和雌激素后p-GlyRS与METTL3的相互作用增加,体外激酶实验表明,p-GlyRS能够使METTL3磷酸化。综上所述,METTL3是BMECs中重要的信号分子,正向调控BMECs中乳蛋白和乳脂肪的合成。METTL3能够正向调控mRNA m~6A水平,正向调控靶基因mTOR和SREBP-1c的mRNA m~6A水平。p-GlyRS与METTL3有直接相互作用,蛋氨酸和雌激素能够促进p-GlyRS与METTL3的结合。体外激酶活性实验表明p-GlyRS能够使GST-METTL3磷酸化。以上实验有助于揭示METTL3调控BMECs中乳蛋白、乳脂肪的分子机制以及p-GlyRS调控METTL3的分子机理。