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目的与意义:表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor, EGFR)在许多肿瘤细胞中异常过量表达,与肿瘤的增殖与转移紧密相关,是肿瘤靶向治疗的重要靶点。西妥昔单抗( cetuximab)是EGFR的全长单克隆抗体,是许多类型恶性肿瘤临床治疗的一线药物。然而,应用西妥昔单抗治疗费用昂贵,且单用其治疗对一些重要肿瘤,包括肝癌的疗效不佳。HER2是EGFR家族的一员,虽然只在少数肿瘤中过量表达,在大多数肿瘤中低量表达,但其在整个EGFR家族信号网络中处于中心位置,是单用西妥昔单抗对一些重要肿瘤疗效不佳的重要原因。研究发现,HER2转录异构体编码的蛋白—Herstatin是HER2的天然抑制物,能与HER2及EGFR高亲和性特异结合,抑制肿瘤细胞增殖及其抗凋亡效应,其C末端的79个氨基酸(HERIN)在结合HER2与EGFR的过程中发挥重要作用。因而,本研究将EGFR单克隆抗体cetuximab与Herstatin C末端79个氨基酸融合,并利用复制缺陷型腺病毒来携带该融合蛋白基因,建立表达EGFR和HER2双特异性抗体的腺病毒治疗系统,作用于EGFR与HER2两个靶点,阻断肿瘤细胞EGFR通路的同时,抑制EGFR家族成员间形成异源二聚体,增强cetuximab对EGFR和HER2双阳性,以及EGFR阳性、HER2弱阳性肿瘤的治疗效果。与此同时,应用全长抗体基因治疗这一新系统,将大幅降低cetuximab治疗的费用,有望建立一套新型高效的恶性肿瘤治疗方法。研究方法:通过双荧光素酶报告系统,比较不同SV40 poly(A)信号序列对上游基因的表达量的调控作用,筛选建立高效的全长抗体表达系统。通过合拉PCR,将抗体cetuximab基因与编码Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)的序列融合,构建携带西妥昔单抗全长基因与Herin融合基因的腺病毒穿梭载体pDC339-AT2-Herin,并在293细胞内包装成重组病毒Ad5-AT2-Herin。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Ad5-AT2-Herin表达全长抗体融合蛋白的体外表达量;应用Western印迹法检测所表达全长抗体轻重链的完整性及均衡性;应用间接免疫荧光法(IFA)检测所表达的融合蛋白与EGFR(+)Her2(-)的A431细胞,以及EGFR(-)Her2(+)的SK-OV-3细胞膜结合的特异性。研究结果:在不同细胞中poly(A)信号序列对上游基因的调控作用存在差异,如293细胞中正反向SV40 poly(A)信号对上游基因的调控无差异,L-02、Hela细胞中正反向SV40 poly(A)信号对上游基因的调控作用差异显著,且正向SV40 poly(A)序列优于SV40 poly(A)序列;ELISA检测分析表明:Ad5-AT2-Herin在293细胞中的表达量为209.3 ng/ml~317.3 ng/ml;Western blot显示轻重链表达平衡,大小符合预期;间接免疫荧光显示腺病毒表达的融合蛋白与A431细胞表面受体EGFR及SK-OV-3细胞表面受体Her2均能特异性结合。研究结论:在不同细胞中poly(A)信号序列对上游基因的调控作用存在差异,且在质粒表达系统、病毒表达系统中,SV40信号序列的调控作用存在差异,最终选定反向SV40 poly(A)信号序列作为抗体基因的调控元件。成功构建携带EGFR和HER2双特异性抗体基因的腺病毒载体Ad5-AT2-Herin,该载体在体外能高效表达双特异性抗体蛋白AT2-HERIN,而且AT2-HERIN蛋白能在体外与EGFR和HER2特异结合。