肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌)是全球第六常见的癌症，亦是我国癌症中的第二号杀手，全球40％以上的肝癌发生在我国。由于肝癌早期诊治困难、预后极差，总5年生存率仅为5～6％。尽管手术治疗仍为目前最重要的治疗手段，但即使是根治性切除，5年内仍有60～70％的病人出现复发转移，切除后复发转移是进一步提高疗效的瓶颈。因此探索肝癌转移复发的机制，评估肿瘤的侵袭能力，预测患者预后，寻找有效的干预靶点，在复发高危人群进行防治成为进一步提高肝癌生存率的关键。但是迄今为止对肝癌转移复发分子机理知之甚少，也缺乏特异有效的治疗手段。近年来研究表明肿瘤的侵袭转移是一个多步骤的复杂动态过程，在这一过程中有多种因素如细胞因子、细胞粘附分子，血管生成因子、细胞外蛋白酶和生长因子等参与了复发转移的过程。越来越多的研究表明肿瘤细胞表面表达的趋化因子受体与趋化因子相互作用在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。起初研究认为趋化因子在介导免疫细胞粘附于内皮细胞、激发其通过血管内皮细胞及组织浸润而招募免疫细胞至炎症部位发挥重要作用。已有的研究表明肿瘤细胞的侵袭及转移与免疫细胞的迁移及浸润有着很多共同点。趋化因子和趋化因子受体的相互作用能引起肿瘤细胞胞膜皱褶和伪足的形成从而诱导肿瘤细胞的趋化性迁移，最终诱导肿瘤细胞从原发部位脱落并通过细胞外基质和血管基底膜，进入血液循环并转移至靶器官。有研究发现六种人肝癌细胞表面均表达有活性的CC趋化因子受体1(CCchemokine receptor 1，CCR1)。本课题组也发现在本所建立的人肝癌细胞系中表达CCR1，RT-PCR和Westem印迹在肝癌组织及相应癌旁肝组织中均可以检测到CCR1 mRNA及蛋白，肝癌组织表达水平高于癌旁肝组织，其表达水平与肝癌侵袭性相关。但是，CCR1在肝癌的侵袭过程中具体作用及分子机制，以及CCR1在判断肝癌侵袭性和预后指标的价值亟需深入研究。本研究依据microRNA (miRNA)介导的RNA干扰(RNAi)原理，以高转移潜能的人肝癌细胞HCCLM3为研究对象，应用pcDNA6.2-GW／EmGFP-miR载体研究体外细胞水平下调CCR1基因表达对肝癌细胞增殖和侵袭性的影响，寻找干扰CCR1基因的最佳作用位点，构建慢病毒载体，探讨以CCR1为靶点抑制肝癌侵袭能力的治疗可行性；初步研究CCR1影响肝癌细胞HCCLM3侵袭能力的分子机制；同时应用免疫组织化学法测定CCR1蛋白在288例肝癌组织芯片内的表达，研究CCR1作为判断肝癌侵袭性和患者预后指标的价值。第一部分应用miRNA介导的RNAi抑制人肝癌细胞CCR1表达的序列筛选和慢病毒载体的构建本研究旨在观察miRNA介导的RNAi是否能够有效抑制高转移潜能人肝癌细胞HCCLM3的CCR1的mRNA及蛋白水平，筛选出最为有效的降低CCR1表达的干扰序列，构建筛选出最有效的降低CCR1表达的miRNA干扰序列的慢病毒载体，为研究CCR1的功能奠定基础。设计并合成3对靶向CCR1 mRNA的寡核苷酸片段，退火后将其连接pcDNA6.2-GW／EmGFP-miR载体构建表达miRNA的真核载体miR-CCR1-85、miR-CCR1-206和miR-CCR1-656，脂质体转染法将重组质粒转入HCCLM3细胞。通过倒置荧光显微镜观察EmGFP来评估转染效率；实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)分析CCR1 mRNA抑制效率；Western印迹测定转染后细胞CCR1蛋白的表达量改变。针对已经筛选确定的CCR1基因RNAi有效靶序列，连接产生LV-miCCR1-656慢病毒载体。质粒共转染包装细胞293T细胞，包装产生慢病毒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果发现转染48小时后转染效率达到高峰，转染效率为70％以上。转染48小时后，转染miR-CCR1-85、miR-CCR1-206和miR-CCR1-656组CCR1 mRNA均较空白对照组和非特异性序列组明显减少；72小时后miR-CCR1-206和miR-CCR1-656组CCR1蛋白表达明显降低；实验表明在CCR1 mRNA和蛋白水平，miR-CCR1-656均有着较miR-CCR1-85和miR-CCR1-206更好的干扰效果。成功构建含干扰CCR1的miRNA序列的慢病毒载体LV-miCCR1-656，慢病毒LV-miCCR1-656感染HCCLM3的效率佳。本实验证明高转移潜能人肝癌细胞HCCLM3的CCR1表达可被miRNA介导的RNAi有效抑制，其中含针对CCR1 mRNA序列设计的pcDNA6.2-GW／EmGFP-miR载体miR-CCR1-656能够高效且特异的抑制高转移潜能人肝癌细胞HCCLM3的CCR1表达，并成功构建针对人CCR1基因miRNA介导的RNAi慢病毒载体。第二部分抑制CCR1表达对人肝癌细胞侵袭性的影响第一部分成功构建能够抑制人肝癌细胞HCCLM3的CCR1表达的载体，为了明确CCR1在肝癌侵袭中的作用，本部分研究miRNA介导的RNAi抑制CCR1的表达对高转移潜能人肝癌细胞HCCLM3增殖和侵袭的影响，并初步探讨其可能分子机制。应用特异性的抑制CCR1表达的载体转染高转移潜能人肝癌细胞HCCLM3后，MTT法检测HCCLM3的增殖能力的变化；Matrigel侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变；明胶酶谱测定转染细胞上清的金属蛋白酶(MMPs)含量的差异。结果表明与空白对照组和非特异性序列组相比，转染含干扰CCR1序列的载体抑制HCCLM3细胞内的CCR1的表达后，HCCLM3细胞的生长没有明显差异(P=0.35)。Matrigel侵袭实验结果显示，转染含干扰CCR1序列的质粒后的HCCLM3细胞穿过人工基底膜的数量较空白对照组和非特异性序列组明显减少，细胞分泌的MMP2明显减少。以上结果表明，肝癌细胞HCCLM3中CCR1的表达被质粒导入的外源性miRNA有效抑制后降低人肝癌细胞侵袭性，但对细胞增殖无明显影响。下调CCR1导致HCCLM3侵袭性减弱可能和MMP2减少有关。本实验结果提示CCR1参与了肝癌细胞HCCLM3的侵袭过程，并可以成为新的治疗靶点。第三部分CCR1作为判断肝癌侵袭性和患者预后的指标价值研究—288例肝癌组织芯片免疫组织化学表达分析前期研究明确了CCR1参与了肝癌细胞HCCLM3的侵袭过程，本部分观察CCR1蛋白在肝癌组织中的表达，探讨肝癌组织中肝癌细胞CCR1蛋白表达与HCC临床病理的关系及其与肝癌侵袭性及患者预后之间的联系，研究CCR1在肝癌侵袭转移和预后评价中的价值。选取1997年1月～2000年12月间在复旦大学附属中山医院肝外科第一次行肝癌切除术，术前均未行化疗及其他抗肿瘤治疗，并经组织病理学检查证实为肝细胞肝癌的288例病例的组织标本石蜡块，用免疫组织化学方法检测CCR1蛋白在288例肝癌组织芯片的表达情况，分析CCR1表达与年龄、性别、肝炎病毒标记物、肝硬化、肿瘤大小、分化、包膜、TNM分期等临床病理特征及患者无瘤生存时间和总体生存时间的关系。结果发现CCR1在肿瘤组织内肝癌细胞的阳性表达率显著高于癌旁组织，且复发组的CCR1阳性率均显著高于未复发组。CCR1阳性组的无瘤生存率显著低于阴性组(P=0.0023)，且显著影响总体生存率。采用Cox比例风险模型，多因素分析显示CCR1染色阳性不仅是肝癌术后无瘤生存时间的独立危险因素，而且是影响肝癌术后总体生存时间的独立危险因素。结果表明肝癌组织中肝癌细胞表达的CCR1与肿瘤侵袭和病人预后密切相关，CCR1表达检测有助于对肝癌术后复发的预测，筛选肝癌术后复发高危病例进行预防性治疗有可能改善这部分病人的预后。结论1．高转移潜能人肝癌细胞HCCLM3的CCR1表达可被miRNA介导的RNAi有效抑制。针对CCR1 mRNA的不同序列的下调CCR1表达的效果不同，其中针对CCR1 mRNA序列设计的pcDNA6.2-GW／EmGFP-miR载体miR-CCR1-656能够特异性和高效的抑制高转移潜能人肝癌细胞HCCLM3的CCR1表达，成功构建含该序列的针对人CCR1基因miRNA介导的RNAi慢病毒载体。2．人肝癌细胞HCCLM3中CCR1的表达被有效抑制后其侵袭性降低。本实验结果提示CCR1与人肝癌细胞HCCLM3侵袭密切相关。CCR1参与人肝癌细胞HCCLM3的侵袭可能和HCCLM3分泌的MMP2有关。3．肝癌组织中肝癌细胞表达的CCR1阳性是影响肝癌术后无瘤生存率和总体生存时间的独立危险因素，说明CCR1与肿瘤侵袭复发和患者预后密切相关，CCR1表达检测有助于对肝癌术后复发的预测。创新点1．肝癌细胞HCCLM3中CCR1的表达可被质粒导入的外源性miRNA有效抑制，进而降低人肝癌细胞侵袭性，CCR1可以成为新的治疗靶点。2．对CCR1调控人肝癌细胞侵袭转移能力的分子机制进行研究，发现CCR1可以调控MMP2的表达参与肝癌细胞侵袭过程。3．通过高通量和大样本的分析发现肝癌组织中肝癌细胞表达的CCR1与肝癌细胞侵袭和预后密切相关，CCR1表达检测有助于对肝癌术后复发的预测。