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全球气候变暖,平均温度不断升高是近几年时刻受到关注的气候变化。气温上升导致生境的变化,生物圈中动物的生理机能、个体大小和生存期缩短。对于性别决定依赖环境的物种而言,温度是影响部分鱼类、两栖类和爬行类等动物群体性别比例的主要因素。在近几年的室内室外研究中,均表明温度的上升对变温动物的性比产生了影响。而温度主要在温敏期影响基因的表达。相关的研究表明是温度影响了性别相关基因的表达变化和性激素的产生,导致性比发生变化,也有少数的研究进一步表明性反转和性比变化中,表观遗传参与了性比基因表达的调控。其中DNA甲基化、组蛋白修饰和mi RNA的调控均有报道,但相关研究只是个别几个基因的表观修饰或DNA甲基转移酶的表达上调,还有很多方面是不清楚的,且发生甲基化的具体位点也不清楚。为了探讨上述问题,本研究采用模式动物斑马鱼为对象,通过正常温度(28℃)、相对低温(23℃)和相对高温(33℃),采用恒温半静态流水培养斑马鱼(10-60天)至性成熟,研究不同温度对斑马鱼群体性别比例的影响。在性比变化的前提下,我们探索了温敏期的时间。进一步在温敏期检测了性别相关基因的表达和热激蛋白的表达。然后,我们检测了DNA甲基转移酶的表达变化和DNA甲基化修饰对性别相关基因表达的调控。以确定温度对性别变化的影响是由DNA甲基化调控的。结果表明:在正常温度(28℃)下,斑马鱼的雌雄比例接近1:1;而在相对低温(23℃)下,斑马鱼的雌雄比例为7:3;而在相对高温(33℃)下,雌雄比例为3:7,进一步的温敏期研究确定为斑马鱼受精后的20-30天。在20-30天检测性别相关基因表达后,结果显示在23℃条件下,雌性相关基因卵巢芳香化酶(cyp19a1a,Cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1a),叉头转录因子(foxl2,Forkhead box L2),雌激素受体1(esr1,Estrogen receptor 1)和性别决定域9b(sox9b,Sex determining region Y-box 9a)的表达明显升高,雄性相关基因抗穆勒氏荷尔蒙(amh,Anti-Müllerian Hormone),双性和mab-3相关转录因子(dmrt1,Doublesex and mab-3 related transcription factor gene 1),性别决定域(sox9b,Sex determining region Y-box 9b),雄激素受体(ar,Androgen receptor)表达降低;而在33℃条件下,雄性相关基因amh,dmrt1,sox9b,ar高温作用下表达显著升高,而雌性相关基因cyp19a1a,foxl2,esr1和sox9b的表达降低。热激蛋白hsp90,hspb1的表达随着温度的升高而升高。而在高温联合了甲基化抑制剂5-AZA处理后,dnmts甲基转移酶dnmt3a2和dnmt3b4的表达降低,性别相关基因esr1和sox9b的表达也降低,表明esr1和sox9b可能受到DNA甲基化的调控。在甲基化特异性PCR和单克隆检测后发现,esr1基因启动子部分的chr20:26459670-26460005区域和sox9b基因启动子部分的chr3:62343318-62343367区域发生了DNA甲基化的修饰。同时,预测了结合在启动子部位Cp G岛片段结合的转录因子,其中,可能调控转录的转录因子有环腺苷酸应答原件连接蛋白(CREB,c AMP-responsive element binding proteins),GATA连接蛋白(GATA,GATA binding factors),SP1转录因子(SP1,GC-Box factors SP1),叉头转录因子(FOX,Fork head domain factors),核因子NFκB及一些锌指结合域(NFκB,Nuclear factor kappa B/c-rel)和性别决定相关的HMG盒因子(SORY,SOX/SRY-sex/testis determing and related HMG box factors),可能发生关键调控的甲基化位点分别为esr1的Cp G5(chr20:26459832),Cp G73(chr20:26459910),及sox9b的Cp G8(chr3:62343326),Cp G34(chr3:62343352),Cp G67(chr3:62343385)。综上所述,本文研究结果证明低温可以使斑马鱼群体雌性化和高温可以使斑马鱼群体雄性化。斑马鱼性比改变的温敏期在20-30天,而温度在温敏期改变性比的原因可能是由于改变了dnmts的变化和性别相关基因esr1和sox9b启动子部位的甲基化来改变群体的性别比率。