【摘 要】
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猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是一种对仔猪具有高致病性的包膜正链RNA病毒,能够引起猪的呕吐、急性腹泻和脱水,严重时可导致猪的死亡,给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV属于冠状病毒科α冠状病毒属成员之一,冠状病毒仅感染脊椎动物,如人、鼠、猪、禽类,其基因组全长约27-32kb,是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。PEDV基因组编码
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猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是一种对仔猪具有高致病性的包膜正链RNA病毒,能够引起猪的呕吐、急性腹泻和脱水,严重时可导致猪的死亡,给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV属于冠状病毒科α冠状病毒属成员之一,冠状病毒仅感染脊椎动物,如人、鼠、猪、禽类,其基因组全长约27-32kb,是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。PEDV基因组编码7个开放阅读框（open reading frames,ORFs）,其中ORF1b编码病毒多聚蛋白pp1b,pp1b蛋白被裂解成非结构蛋白nsp12-16。Nsp15具有病毒核酸内切酶活性,参与病毒复制和发病机理。可是在转录组水平上分析PEDV nsp15蛋白表达对宿主细胞基因表达谱的影响,以及探究nsp15对细胞基因的调节作用尚未见报道。本论文探究了PEDV nsp15蛋白对细胞转录组的影响,发现nsp15蛋白的新功能,从而加深了我们对PEDV发病机制的理解。首先我们利用分子克隆技术将PEDV nsp15基因分别构建至p MAL-c2X和p CAGGS-HA载体上,获得p MAL-c2X-nsp15原核表达载体和p CAGGS-HA-nsp15真核表达载体。原核方面:将p MAL-c2X-nsp15转化至BL21（DE3）,摸索表达温度、表达时间和诱导剂浓度,优化nsp15重组蛋白的表达条件,获得的重组蛋白胶回收后多次免疫小鼠制备nsp15多克隆抗体,并通过免疫印迹鉴定抗体具有特异性。真核方面:将真核表达载体p CAGGS-HA-nsp15分别转染IPEC-J2细胞和Vero细胞,免疫荧光和免疫印迹等实验确定细胞表达nsp15蛋白后,提取细胞RNA后进行真核有参转录组测序,生物信息学方法分析nsp15对细胞基因表达的影响。通过对转录组数据进行分析,Vero组测序共测得35538个基因,筛选出差异基因606个,包括上调基因372个,下调基因234个。GO富集显示差异基因显著富集于33条GO分类,28条涉及分子功能,如金属离子跨膜转运体活性、钾离子通道活性等。KEGG富集表明10条通路被显著富集,包括MAPK信号通路和IL-17信号通路等。IPEC-J2组测序共获得21654个基因,其中差异表达基因415个,包括136个上调基因,279个下调基因。这些差异基因显著富集于32条GO分类,其中25条参与了生物过程。KEGG富集分析显示,差异基因主要富集于甲型流感、NOD样受体信号通路、TNF信号通路等免疫相关通路。另外,我们对IPEC-J2细胞转录组中差异SNP和In Del位点进行了统计并分析了发生在外显子区域的差异位点。趋化因子调节炎症和免疫反应等生理过程,我们转录组测序发现nsp15显著下调CCL5、CXCL8、CXCL10趋化因子的表达。而PEDV感染细胞能够诱导相关趋化因子的表达剧增,为了探究趋化因子是否能够对病毒的复制增殖起调控作用。本研究构建了CCL5、CXCL8、CXCL10趋化因子的过表达载体,在IPEC-J2细胞中过表达后发现能够显著抑制病毒增殖。综上所述,我们通过优化表达条件获得了原核表达的nsp15重组蛋白,免疫鼠制备nsp15抗血清,并且首次报道了nsp15转染Vero细胞和IPEC-J2细胞后的转录组文件,通过转录组数据发现nsp15能够显著下调CCL5、CXCL8、CXCL10趋化因子的表达,从而有助于病毒的复制增殖。这些结果拓宽了我们对nsp15促进病毒复制和发病机制的认识,也为抗PEDV特异性药物的研发提供了新思路。
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