【摘 要】
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绿原酸作为天然药用植物金银花的主要功效成分之一,具有抑菌消毒、抗氧化、预防心血管疾病和动脉粥样硬化等生理活性;在食品、保健品、药品以及日用化妆品等领域有着广泛的应用前景,因此人们越来越重视绿原酸的高效生物合成途径中关键基因的探究以及关键基因的遗传转化和应用。本实验在课题组前期探索的金银花绿原酸合成途径关键基因的基础上,首先研究关键基因过表达对金银花细胞内次生代谢产物和抗氧化能力积累的影响;其次采用
【基金项目】
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国家自然科学基金项目:基于食物成分相互作用及代谢组学技术构建咖啡酰奎宁酸高效生物利用食物运载体系及其机理研究,项目编号:32060535； 国家自然科学基金项目:金银花细胞悬浮培养生物积累咖啡酰奎宁酸的诱导调控及其分子机制,项目编号:31560452； 江西省科技计划项目:基于细胞悬浮培养技术高效生物积累绿原酸类物质工艺研
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绿原酸作为天然药用植物金银花的主要功效成分之一,具有抑菌消毒、抗氧化、预防心血管疾病和动脉粥样硬化等生理活性;在食品、保健品、药品以及日用化妆品等领域有着广泛的应用前景,因此人们越来越重视绿原酸的高效生物合成途径中关键基因的探究以及关键基因的遗传转化和应用。本实验在课题组前期探索的金银花绿原酸合成途径关键基因的基础上,首先研究关键基因过表达对金银花细胞内次生代谢产物和抗氧化能力积累的影响;其次采用RT-PCR法克隆金银花绿原酸合成途径关键基因并构建过表达载体;最后利用农杆菌介导的愈伤组织转化法获得转基因愈伤组织并测定转基因愈伤组织中绿原酸含量。主要试验结果如下:（1）研究关键基因过表达对金银花细胞内次生代谢产物以及抗氧化能力的影响:利用诱导子上调关键基因表达,测定金银花细胞内绿原酸类物质、多酚、黄酮含量的积累,POD和PPO活力以及DPPH、ABTS自由基的清除能力、铁离子的还原能力的变化,最佳值出现在诱导后第6或第7天。绿原酸类物质、黄酮和多酚最高含量分别是对照组4.52倍、3.04倍和4.84倍,野生金银花芽的3.13倍、5.32倍和6.56倍;POD和PPO最大活力分别是对照组的3.05和3.26倍,野生金银花芽的6.40倍和2.56倍;最大DPPH、ABTS自由基的清除能力、铁离子的还原能力分别是对照组的2.62倍、3.50倍和2.55倍,野生金银花芽的4.91倍、6.17倍和7.12倍。为分析关键基因过表达对金银花细胞内次生代谢产物以及抗氧化能力的调控规律提供数据参考。（2）绿原酸合成途径关键基因的克隆及过表达载体的构建:以金银花细胞cDNA为模板,通过RT-PCR方法克隆C4H和HCT基因,以PstI和ECoRI为限制性酶切位点,成功构建pCAMBIA1302-HCT和pCAMBIA1302-C4H过表达载体,导入农杆菌EHA105感受态细胞,为目的基因转入水稻愈伤组织做铺垫。（3）农杆菌介导的目的基因转化以及转基因愈伤组织绿原酸含量的测定:试验以粳稻日本晴的种子为模型,建立水稻愈伤组织和增殖培养体系,以Hyg和Carb为转基因筛选过程中的抑菌剂和筛选剂,优化出的最佳Hyg和Carb浓度分别为40mg/L和200 mg/L。采用农杆菌介导的愈伤组织转化法,将pCAMBIA1302-HCT和pCAMBIA1302-C4H过表达载体导入水稻愈伤组织,并通过HPLC法测定愈伤组织绿原酸含量,转基因水稻愈伤组织的绿原酸含量和对照组没有显著性差异。
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