研究背景MICA(主要组织相容性复合体I类链相关基因A)属于非经典的HLA I类分子，基因定位于人类第6号染色体。研究证实MICA与HLA I类分子高度相似，但MICA和经典HLA I类分子存在不同。MICA既不和β2微球蛋白结合，又不提呈抗原肽，但可与NKG2D受体结合调节NK细胞和T细胞功能。MICA和经典的HLA I类分子一样，具有高度的遗传多态性，目前已经报道有64个等位基因。MICA的多态性主要集中在它的2、3、4、5号外显子，部分在1和6号外显子。其中5号外显子比较特殊，它含有不同数目的GCT三联重复序列，目前已经发现至少有八种不同的三联体数目，A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10以及A5．1，A后面的数字代表GCT三联体的重复数目，A5．1代表在A5的第二个(GCT)后面多了一个G。研究报道MICA和一些自身免疫性疾病、肿瘤疾病的发生存在一定的关联，新近研究证明抗供体HLA和MICA抗体均为阴性的患者器官移植效果更佳，存活时间长，但是现在MICA的功能还有许多方面不明确。我们拟建立准确的MICA检测方法，并检测浙江汉族人群的遗传多态性分布，为进一步深入研究MICA功能作用提供基础。目前国内外检测MICA主要为对2、3、4号外显子进行直接测序并结合GeneScan技术检测5号外显子进行分型，或单独采用GeneScan方法对MICA五号外显子多态性分布进行研究，这类方法均存在不能有效区分部分MICA等位基因的问题。本研究我们设计方法对MICA 2-6号外显子进行直接测序，并采用GeneScan方法对5号外显子进行分型，建立了一种系统、全面、准确的MICA基因分型方法，并首次在人群中对5、6号外显子进行了序列分析。我们建立的MICA分型方法完善了以前的分型技术，获得了浙江汉族人群MICA的遗传多态性资料，为进一步研究MICA功能提供了科学基础。实验方法1、标本来源：标本来自自愿无偿献血者，征集同意后采集血样进行研究。标本采集量为EDTA抗凝全血5ml，贮存在-20℃以下待实验。标本总数为100例。2、标本DNA提取：采用Pel-Freeze DNA商用抽提试剂盒。3、2-6外显子测序分析3．1 PCR扩增：引物参照MICA基因序列，采用两对引物分别对2-6外显子进行扩增。其中第1对引物可扩增MICA 2-5号外显子，另1对引物扩增第5、6号外显子。PCR引物序列和扩增条件参照正文，扩增反应体系总体积为25μl。3．2 PCR产物纯化：每孔中加入核酸外切酶Ⅰ1μl(5U)，虾碱性磷酸酶2μl(2U)，ABI公司的9700型PCR自动扩增仪进行酶切反应，37℃30min，80℃15min。3．3测序反应：分别针对外显子2、3、4、5、6设计测序引物，进行双向测序。以纯化PCR产物为模板按BigDye Sequencing kit(ABI公司)试剂盒操作进行测序反应，ABI公司9700型PCR自动扩增仪扩增，扩增条件为95℃预变性5min，95℃30s，50℃10s，60℃4min，30个循环，冷却至4℃。3．4测序反应纯化和电泳分析：采用乙醇／醋酸钠法纯化，然后在ABI 3730测序仪上进行测序电泳分析。3．5测序结果分析和判断：采用Assign 3．5分析软件和MT Navigator软件进行数据分析，由Assign 3．5软件指定最终结果。4、GeneScan检测5号外显子GCT重复数量4．1 GeneSean扩增：引物参照有关文献，正向引物5’端标记有FAM荧光集团。引物序列和扩增条件参照正文，扩增反应体系为20μl。4．2 GeneScan上机检测：GeneScan扩增产物1：10稀释后，取5μl PCR产物+4．8μl甲酰胺+0．2μl内标充分混匀，95℃4min变性后，在ABI 3730测序仪上进行GeneScan模式分析。4．3 GeneScan结果分析和判断：采用GengMapper v3．7自动判断结果，根据片段长度大小推测GCT重复次数，并与5号外显子测序结果进行验证。5、MICA缺失型等位基因检测：采用PCR-SSP的方法，引物参照有关文献，一对引物扩增MICA*Del等位基因的保守序列，另外一对引物扩增人类生长激素的同源保守序列，引物序列和扩增条件见正文，扩增反应体系为10μl。6、HLA-B位点参照本实验以前建立的检测方法，采用PCR-SBT方法。7、统计学分析：人群基因频率(gene frequency，GF)采用直接计数法计算，即检测出的基因个数／2N(N=标本数)。单倍型频率(haplotype frequency，HF)和连锁不平衡(LD)计算采用Arlequin 3．01软件进行分析，Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验参照Guo和Thompson的文献，p<0．05表示具有统计学意义。结果1、测序方法情况：两对引物分别扩增MICA 2-6外显子，可得到很强的特异性条带。双向测序反应后可得到清晰的测序序列，软件可直接自动指定MICA等位基因，建立的测序方法具有可行性。2、标准序列分析：验证了MICA*019序列，序列已递交GenBank，序列号为EU267602。纠正MICA命名数据库中MICA*019等位基因1个碱基错误(1073bp T→A)，并得到WHO命名委员会的认可。3、浙江汉族人群中MICA等位基因分布情况：检测到MICA等位基因数目为14个，分布相对比较集中，最常见等位基因为MICA*00801／04。等位基因的频率分别为MICA*00801／04(27．0％)、MICA*010(18．5％)、MICA*00201(15．5％)、MICA*019(9．5％)、MICA*00901(8．0％)、MICA*027(7．0％)、MICA*01201(5．0％)、MICA*049(3．5％)、MICA*045(1．5％)、MICA*00802(1．5％)、MICA*00701(1．0％)、MICA*Del(1．0％)、MICA*004(0．5％)、MICA*00902(0．5％)。MICA等位基因分布数据统计分析，观察杂合度为0．83，预期杂合度为0．84，p=0．75。4、浙江汉族人群中MICA等位基因5号外显子STR分布情况：共发现五种重复数量：A4、A5、A5．1、A6、A9和缺失型。A5频率(35％)最高，其次是A5．1(28．5％)、A9(15．5％)、A6(12．5％)、A4(7．5％)、MICA*Del(1．0％)。STR分布数据统计分析，观察杂合度为0．74，预期杂合度为0．749，p=0．96。5、HLA-B基因分布情况：检测到40种不同的等位基因，分别为B*4001(11．5％)、B*4601(9％)、B*5101(6．5％)、B*5801(6．5％)、B*1502(6％)、B*1501(5％)、B*1302(4．5％)、B*5201(3．5％)、B*0702(3％)、B*1511(3％)、B*4006(3％)、B*5401(3％)、B*3501(2．5％)、B*3802(2．5％)、B*4002(2．5％)、B*5502(2．5％)、B*3701(2％)、B*3901(2％)、B*4402(2％)、B*0705(1．5％)、B*0801(1．5％)、B*1301(1．5％)、B*1527(1．5％)、B*2704(1．5％)、B*3503(1．5％)、B*4403(1．5％)、B*5102(1．5％)、B*2705(1％)、B*4801(1％)、B*1507(0．5％)、B*1505(0．5％)、B*1513(0．5％)、B*2706(0．5％)、B*2707(0．5％)、B*3505(0．5％)、B*3801(0．5％)、B*3905(0．5％)、B*5001(0．5％)、B*6701(0．5％)、B*8101(0．5％)。HLA等位基因分布数据经过统计分析，观察杂合度为0．97，预期杂合度为0．95，p=0．33。6、MICA和HLA-B单倍型频率及其连锁情况分析：采用Arlequin软件分析后得到58种单倍型，单倍型频率分布比较离散(以MICA*00801表示MICA*00801／04)。分别为MICA*00801-B*4001(11．5％)、MICA*010-B*4601(8．0％)、MICA*00201-B*5801(6．5％)、MICA*019-B*1502(5．0％)、MICA*00801-B*1302(4．0％)、MICA*010-B*1501(4．0％)、MICA*049-B*5101(3．5％)、MICA*01201-B*5401(3．0％)、MICA*00901-B*5201(3．0％)、MICA*010-B*1511(3．0％)、MICA*027-B*4006(3．0％)。MICA*00201-B*3501、MICA*00201-B*3802、MICA*00801-B*0702、MICA*00901-B*5101为2．5％；MICA*01201-B*5502、MICA*00801-B*3701、MICA*00801-B*4402为2．0％。MICA*00201-B*3503、MICA*00801-B*0801、MICA*00801-B*3901、MICA*00802-B*0705、MICA*010-B*1527、MICA*019-B*2704、MICA*027-B*4002为1．5％；MICA*Del-B*4801、MICA*019-B*1501、MICA*00901-B*4403、MICA*00901-B*5102、MICA*045-B*1301为1．0％；MICA*00201-B*3505、MICA*00201-B*3801、MICA*00201-B*3901、MICA*00201-B*5201、MICA*00201-B*6701、MICA*004-B*4403、MICA*00701-B*1301、MICA*00701-B*2705、MICA*00801-B*2706、MICA*00801-B*5502、MICA*00801-B*3905、MICA*00801-B*4002、MICA*00901-B*4001、MICA*00902-B*5001、MICA*010-B*1505、MICA*010-B*2705、MICA*010-B*2707、MICA*010-B*8101、MICA*019-B*4001、MICA*019-B*4002、MICA*019-B*4601、MICA*019-B*5102、MICA*027-B*1502、MICA*027-B*1513、MICA*027-B*1527、MICA*027-B*4601、MICA*027-B*5101、MICA*045-B*1302分别为0．5％。连锁不平衡分析显示：MICA*00801-B*4001(D=0．081，D’=0．890，r~2=0．31，X~2=61．24，p<0．001)、MICA*010-B*4601(D=0．063，D’=0．863，r~2=0．32，X~2=65．00．p<0．001)、MICA*00201-B*5801(D=0．055，D’=1．000，r~2=0．38，X~2=75．80，p<0．001)、MICA*019-B*1502(D=0．045，D’=0．899，r~2=0．45，X~2=89．73，p<0．001)、MICA*00801-B*1302(D=0．028，D’=0．848，r~2=0．092，X~2=18．31，p<0．001)、MICA*010-B*1501(D=0．031，D’=0．755，r~2=0．13，X~2=26．41，p<0．001)，呈现高度连锁。频率小于4．0％的单倍型连锁分析数据见正文。7、MICA5号外显子GCT重复数量与HLA-B基因关联性分析：采用Arlequin软件分析后得到48种单倍型，单倍型频率分布比较离散，分别为A5．1-B*4001(11．5％)、A5-B*4601(9％)、A9-B*5801(6．5％)、A5-B*1502(5．5％)、A6-B*5101(5．5％)、A5-B*1501(5．0％)、A5.1-B*1302(4％)、A4-B*5401(3％)、A5-B*1511(3％)、A5-B*4006(3％)、A6-B*5201(3％)、A5．1-B*0702(2．5％)、A9-B*3501(2．5％)、A9-B*3802(2．5％)、A4-B*5502(2％)、A5-B*1527(2％)、A5-B*4002(2．0％)、A5．1-B*3701(2％)、A5．1-B*4402(2．0％)、A4-B*1301(1．5％)、A5-B*2704(1．5％)、A5．1-B*0705(1．5％)、A5．1-B*0801(1．5％)、A5．1-B*3901(1．5％)、A6-B*4403(1．5％)、A6-B*5102(1．5％)、A9-B*3503(1．5％)、A5-B*5101(1％)、Del-B*4801(1％)、A4-B*1302(0．5％)、A4-B*2705(0．5％)、A5-B*1505(0．5％)、A5-B*1513(0．5％)、A5-B*2707(0．5％)、A5-B*2705(0．5％)、A5-B*4001(0．5％)、A5-B*8101(0．5％)、A5．1-B*2706(0．5％)、A5．1-B*3905(0．5％)、A5．1-B*4002(0．5％)、A5．1-B*5502(0．5％)、A6-B*4001(0．5％)、A6-B*5001(0．5％)、A9-B*3505(0．5％)、A9-B*3901(0．5％)、A9-B*3801(0．5％)、A9-B*5201(0．5％)、A9-B*6701(0．5％)。连锁不平衡分析显示：A5．1-B*4001(D=0．079，D’=0．888，r~2=0．28，X~2=56．54，p<0．001)、A5-B*4601(D=0．059，D’=1．000，r~2=0．18，X~2=36．73，p<0．001)、A9-B*5801(D=0．055，D’=1．000，r~2=0．38，X~2=75．80，p<0．001)、A5-B*1502(D=0．036，D’=1．000，r~2=0．11，X~2=21．62，p<0．001)、A6-B*5101(D=0．047，D’=0．824，r~2=0．33，X~2=66．11，p<0．001)、A5-B*1501(D=0．033，D’=1．000，r~2=0．098，X~2=19．55，p<0．001)，呈现高度连锁。频率小于5．0％的单倍型连锁分析数据见正文。8、MICA缺失型等位基因检测：在浙江汉族100例标本中，2例携带HLA-B*4801的标本MICA缺失型等位基因阳性(阳性率为1％)，其它98例标本均未检测出MICA*Del。在另外有选择性的8例HLA-B*4801标本中，有6个标本含有MICA*Del。结果证实在浙江汉族人群中存在MICA等位基因缺失型，并且缺失型与HLA-B*4801高度关联。结论1、本研究建立的MICA2-6外显子测序方法和GeneScan技术检测5外显子是可行的。2、验证了MICA*019等位基因，得到WHO命名委员会的认可。3、获得了浙江汉族人群MICA基因遗传多态性数据。4、在等位基因水平获取了MICA-HLA-B连锁遗传数据。5、在等位基因水平获取了MICA STR-HLA-B连锁遗传数据。6、证实中国人群中存在MICA等位基因缺失，并与HLA-B*4801关联。