草菇乙酰木聚糖酯酶的重组表达及其酶学特性

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食用菌草菇中的乙酰木聚糖酯酶基因之前已被克隆出来。为了乙酰木聚糖酯酶能够在毕赤酵母表达体系中高效表达,我们根据毕赤酵母偏爱密码子,设计了26条寡核苷酸链,并通过PCR技术合成了乙酰木聚糖酯酶全基因。合成的乙酰木聚糖酯酶基因的cDNA(GenBank的编号为DQ888226)由349个氨基酸编码构成,长度为1363bp,分子量为39,990 Da。而后重组乙酰木聚糖酯酶基因在巴斯德毕赤酵母中表达了出来,并对表达条件进行了优化,包括通过两种不同培养基(BMMH和BMMY),培养基中不同YNB的浓度,不同接种量,不同起始pH以及甲醇添加量,研究了这些不同培养条件对产酶表达的影响。酵母工程菌的最佳表达条件为:BMMY培养基,100%YNB,接种量为OD600=30,起始pH为6.0,在甲醇浓度为1.0%时诱导表达。表达出的乙酰木聚糖酯酶的纯化方法是用胶Ni-NTA Agarose进行亲和层析,后经SDS-PAGE电泳分析发现纯化的重组乙酰木聚糖酯酶出现了48 kDa和66 kDa两条带,用内切糖苷酶endo H处理后,变成45kDa的一条带。酶活的测定方法是以4-methylumbelliferyl acetate为底物,测定其反应最初2分钟的吸光值变化。酶活测定的最适条件为:pH 8.0,50℃。以4-methylumbelliferyl acetate为底物的酶动力学参数为:Km=307.69μM,Vmax=769.23IU/μM。重组乙酰木聚糖酯酶有较广泛的底物专一性,对底物acetyl xylan, tetra-acetate xylose和α-naphthyl acetate都有水解能力。其中对底物tetra-acetate xylose有着最高的特异性酶活(52450 IU/μmol),对底物α-naphthyl acetate的活性较低,只有tetra-acetate xylose的1.8%。论文还对乙酰木聚糖酯酶的吸附性能作了研究,发现它对微晶纤维素(上清液剩余酶活下降为77.3%)和磷酸润涨纤维素(上清液剩余酶活下降为12.0%)有较强的吸附能力,但对不可溶木聚糖(上清液剩余酶活下降为92.2%)没有表现明显的吸附能力。
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