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蛋白酶抑制剂通过抑制蛋白酶的活性来调节蛋白酶的功能，在维持生命体的正常生长发育，抗虫抗病等生命活动中发挥重要作用，广泛分布于动植物、细菌、真菌和病毒等生物体内。丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPIs）是研究最为广泛的一类蛋白酶抑制剂。SPIs主要调节蛋白酶的水解级联反应，调控动物体内凝血反应、炎症反应、组织修复和细胞凋亡等生命过程，在植物体中，丝氨酸蛋白酶抑制剂还可以防御昆虫和病原菌的侵害，调控逆境中蛋白酶的过度水解破坏，增加机体的抗虫抗菌性。按照作用机理可以将丝氨酸蛋白酶抑制剂分为三类:典型丝氨酸蛋白酶抑制剂、非典型丝氨酸蛋白酶抑制剂、serpin类型丝氨酸蛋白酶抑制剂。典型丝氨酸蛋白酶采取传统的锁钥模型结合底物，而serpin类型抑制剂则是通过活性中心环状区(RCL)与底物以牢固的共价结合方式形成复合体，产生不可逆的抑制效果。 本论文对前期工作中通过活性电泳分离和MALDI-TOF-MASS质谱鉴定得到的家蚕体壁胰蛋白酶抑制剂SW-AT-1的酶学性质进行研究。SW-AT-1在UniProt登陆号为C7ASM9，在NCBI中的命名为silkworm antitrypsin isoform1(GenBank: FJ613793)，生物信息学分析表明该蛋白酶抑制剂负电荷残基总数为49，正电荷残基总数为42，在家蚕体内属于分泌蛋白，没有跨膜区域。由Smart软件的结构分析中得知，SW-AT-1由一个serpin domain（28-390氨基酸残基）和一段信号肽（1-16氨基酸残基）组成。前期研究表明，SW-AT-1同时具有抑制胰凝乳蛋白酶的作用。 对SW-AT-1蛋白三级结构的预测及生物信息学分析显示，SW-AT-1的RCL是结构域中的一个凸出暴露区域，该区域是控制SW-AT-1功能的关键部位。SW-AT-1的关键作用位点由10个氨基酸组成，其中氨基酸位点G327，A328，E329和A330位于RCL的N-端，F352，N353，A354，N355，K356和P357位于RCL的C-端，通过PCR引物的设计对这10个氨基酸进行定点突变，将突变的基因片段与原核表达载体pET-28a连接，得到pET-28a-SW-AT-1及原核表达突变体G327A、A328G、E329G、A330G、F352A、N353D、A354G、N355S、K356G和P357G，将构建好的表达载体转化大肠杆菌DE-3，利用Ni-NTA亲和层析法纯化突变蛋白。SW-AT-1突变体的表达量分析表明，突变体原核表达的蛋白量均低于野生型，A328G的表达量仅为野生型的58％。结合serpin的三级结构分析可知，RCL的N端区域氨基酸残基的突变会改变SW-AT-1的折叠方式，从而影响蛋白酶抑制剂的结构与功能，因此表现出蛋白表达量的下降。 纯化10个突变体蛋白活性分析表明，突变体G327A和E329G在功能上表现出最大程度的抑制活性降低，对纯化蛋白进行酶动力学分析，计算出SW-AT-1及突变体与胰蛋白酶反应的SI值为1.2、2.54、1.35、4.41、1.39、1.38、1.44、1.35、1.33、1.42、1.3，SW-AT-1及突变体与胰凝乳蛋白酶反应的SI值为1.3、2.44、4.25、1.3、1.45、1.48、1.4、1.5、1.38、1.35。SW-AT-1及突变体与胰蛋白酶反应的ka为1.62×105M-1S-1、0.89×105M-1S-1、1.66×105M-1S-1、1.88×105M-1S-1、1.53×105M-1S-1、1.68×105M-1S-1、1.43×105M-1S-1、1.45×105M-1S-1、1.54×105M-1S-1、1.66×105M-1S-1，SW-AT-1及突变体与胰凝乳蛋白酶反应的ka为1.77×104M-1S-1、3.12×104M-1S-1、1.27×104M-1S-1、4.13×104M-1S-1、2.77×104M-1S-1、3.02×104M-1S-1、2.36×104M-1S-1、2.97×104M-1S-1、2.54×104M-1S-1、3.41×104M-1S-1。SW-AT-1与胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的SI值表示反应过程消耗抑制剂与底物酶分子量的比值，通过与突变体SI数值的比较可知，突变体G327A与E329G的SI数值大约达到野生型的3倍，表明SW-AT-1的RCL中327、329氨基酸的突变，导致了蛋白酶抑制剂抑制与底物酶结合能力降低，影响抑制剂的反应效率。Ka可以直观的反应出SW-AT-1与底物酶反应的速率。突变体G327A、E329G与野生型蛋白的k a值相差较大，G327和E329这两个位点氨基酸的突变造成抑制剂与底物酶反应速率明显下降。突变体与野生型纯化蛋白SI与ka数值的测定，说明SW-AT-1的RCL结构的N端两个氨基酸残基G327、E329是影响RCL发挥抑制活性的关键位点，这两个位点氨基酸残基的改变会引发SW-AT-1活性的明显降低。 SW-AT-1基因分别与pCAMBIA-1304载体和插入CaMW35S-ubi串联启动子的pCAMBIA-1304载体连接后，构建重组表达载体，通过农杆菌侵染的方法将重组载体导入水稻悬浮细胞中，并在水稻悬浮细胞总蛋白中检测到胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶抑制剂活性，表明外源SW-AT-1基因的插入对植物体内蛋白的活性产生影响。但是由于外源蛋白表达量过低，携带不同启动子的重组蛋白的表达活性差别不大。SW-AT-1基因在水稻悬浮细胞中的表达可以抑制细胞内源蛋白酶的活性，该转基因悬浮细胞系的建立有望减少细胞内源蛋白对外源基因表达的干扰，对于提高外源蛋白在水稻悬浮细胞中的表达量具有重要意义。