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链霉菌胰蛋白酶（Streptpmyces trypsin, SGT, EC3.4.21.4）是由灰色链霉菌（Streptomyces griseus）所产生的丝氨酸蛋白酶中的一种重要类型。胰蛋白酶的专一催化水解特性使其在皮革加工、医药、食品加工中存在广泛应用。链霉菌胰蛋白酶与哺乳动物胰蛋白酶在结构与功能上高度相似，并且由于其微生物来源的特性，从而避免了哺乳动物胰蛋白酶的免疫原性，且利用微生物产胰蛋白酶有利于酶品质的控制。目前对胰蛋白酶的需求主要依赖哺乳动物胰蛋白酶，而利用链霉菌发酵产胰蛋白酶发酵周期长，产量低，因此利用基因工程技术产重组链霉菌胰蛋白酶，并通过蛋白质工程手段对重组酶进行改造将有助于链霉菌胰蛋白酶的开发利用。本研究将链霉菌胰蛋白酶在P. pastoris系统中进行表达，分别就其前导肽进行理性设计，对重组酶酶学性质进行比较分析，对其自降解loop环中关键氨基酸R145进行定点突变，以及重新设计链霉菌胰蛋白酶自活化融合突变体提高重组酶产量，主要研究结论如下：（1）链霉菌胰蛋白酶在毕赤酵母中的表达及初步优化将链霉菌胰蛋白酶编码基因mt搭配不同启动子pGAP，pAOX1，pFLD在不同的毕赤酵母宿主（P. pastoris GS115，P. pastoris SMD1168，P. pastoris X33，P. pastoris KM71）中进行异源表达，确定最佳启动子和宿主搭配为：pAOX1和P. pastoris GS115。确定重组菌P. pastoris GS115/pAOX1/mt摇瓶发酵产重组酶的适宜条件为：诱导剂甲醇浓度为20g·L–1，诱导温度为30°C，最佳辅助碳源为4g·L–1甘油，经过挡板摇瓶发酵5天，重组链霉菌胰蛋白酶表达水平为9.6U·mL–1。采用高密度发酵技术，以4g·L–1甘油为诱导阶段辅助碳源，在3L发酵罐水平，重组菌P. pastoris GS115/pAOX1/mt产重组链霉菌胰蛋白酶表达水平为15.6U·mL–1。（2）基于链霉菌胰蛋白酶前导肽功能分析新型胰蛋白酶的设计通过链霉菌胰蛋白酶原及其缺失突变体的表达，证明在链霉菌胰蛋白酶原前导肽中，抑制胰蛋白酶成熟酶活性的主要是靠近成熟酶N端P1位的脯氨酸残基，并且发现链霉菌胰蛋白酶维持正确构象的作用力主要包括：a，二硫键（C42-C58，C168-C182，C191-C220）所形成的盐键作用力；b，N端与催化区域的氢键作用力（V16-loopD189-D194）；c，维持活性中心刚性的氢键作用力（H57-D102，H57-S195）。经过对前导肽的理性设计，获得新型链霉菌胰蛋白酶突变体Exmt（YVEFmt）和IVEFmt，对酰胺键的比酶活由852U·mg–1降低至242U·mg–1，因此，Exmt是在链霉菌胰蛋白酶N端残留有前导肽的改良突变体。（3）重组链霉菌胰蛋白酶Exmt的酶学性质比较及分析将重组链霉菌胰蛋白酶Exmt与野生链霉菌胰蛋白酶wSGT和牛胰蛋白酶BT进行酶学性质比较和分析，Exmt和野生wSGT的最适反应pH为8.0，与牛胰蛋白酶BT的最适反应pH为10，Exmt N端残留前导肽YVEF改善了链霉菌胰蛋白酶的pH稳定性；wSGT和Exmt最适反应温度为50°C，BT的最适反应温度为60°C。Exmt在40°C，50°C，60°C下，其半衰期分别提高了1.8倍，2.5倍，31.3倍。Exmt N端前导肽增加了链霉菌胰蛋白酶对金属离子抑制或促进作用的敏感性，减弱了链霉菌胰蛋白酶的部分有机溶剂抗性，而机溶剂对Exmt的酯酶活力起到了明显的促进作用。由于其N端前导肽YVEF的存在，Exmt对BAPNA和BAEE底物的催化效率分别提高3.1和5.5倍。由于YVEF的存在使得链霉菌胰蛋白酶的蛋白质结构的柔性增加及分子内氢键的增加，从而使得其催化效率提高，pH耐受性和热稳定性得以改善。（4）自降解位点R145突变对链霉菌胰蛋白酶催化特性及表达的影响通过对Exmt中R145进行突变，在摇瓶发酵水平，各突变体的重组链霉菌胰蛋白酶产量均增加。其中Exmt（R145I）突变体的酰胺酶比酶活为1242.85±99.15U·mg–1，比未突变的重组酶和野生酶分别提高0.5倍和2.6倍；Exmt（R145I）突变体的酯酶比酶活为101491.58±1225.56U·mg–1，比未突变的重组酶和野生酶分别提高0.3倍和2.9倍。Exmt（R145I）对酰胺键底物催化效率提高0.2倍；其对酯键底物亲和力提高0.3倍。Exmt（R145I）的抗自降解性能亦有所提高。采用高密度发酵技术，以4g·L–1甘油为诱导阶段辅助碳源，在3L发酵罐水平，重组菌P. pastoris GS115/pAOX1/Exmt（R145I）产重组链霉菌胰蛋白酶表达水平为18.7U·mL–1。（5）自活化融合突变体高效表达重组链霉菌胰蛋白酶杂交链霉菌胰蛋白酶原VD4Kmt由于前导肽VD4K包埋于蛋白质N端，无法实现表达时的自活化，需经过体外肠激酶进行活化。而自活化融合突变体TLmt（D4K）经摇瓶发酵5天，胞外酰胺酶产量可达5.8U·mL–1，与单独表达链霉菌胰蛋白酶时的摇瓶发酵产量相近。其自活化方式是在表达过程中，通过有活性的链霉菌胰蛋白酶部分将融合蛋白TrxA连同linker部分切除，从而得到自活化后的链霉菌胰蛋白酶。采用高密度发酵技术，以4g·L–1甘油为诱导阶段辅助碳源，在3L发酵罐水平，重组菌P. pastoris GS115/pAOX1/TLmt（D4K）产重组链霉菌胰蛋白酶表达水平为19.85U·mL–1。