论文部分内容阅读
CD47也称整合素相关蛋白(integrin-associated protein,IAP),是一个由5次跨膜结构域和一个免疫球蛋白样的胞外域及一个可变剪接的胞内段组成的膜蛋白,其与表达于巨噬细胞等固有免疫细胞表面的配体SIRPα结合抑制巨噬细胞的吞噬作用。很多肿瘤细胞通过过表达CD47抑制固有免疫的抗肿瘤效应。CD47-SIRPα通路也被称为固有免疫检验点,通过抗体阻断该通路是当前一个很有前景的免疫治疗策略。然而由于CD47在正常细胞普遍表达,尤其是在红细胞和血小板表面高表达,使得抗CD47抗体Fc结构与其受体相互作用,可能使红细胞和血小板发生凝聚、并引发贫血和血小板减少等副作用,并且降低抗体的疗效。本研究利用纳米抗体不含Fc的特点,通过在CD47纳米抗体上连接一段可被肿瘤特异蛋白酶水解的遮蔽肽,形成钝化形式的CD47纳米抗体前抗体,以期能在肿瘤部位特异激活CD47纳米抗体,从而克服其对正常细胞的毒性。研究内容主要包括以下三个方面:1.CD47纳米抗体前抗体的制备采用一段与CD47抗原具有竞争结合作用的12肽作为CD47纳米抗体的遮蔽肽(简称CERX),由此构建钝化形式的CD47纳米抗体。同时,为了使CD47纳米抗体能在肿瘤部位特异激活,我们在遮蔽肽和纳米抗体之间设计了一段对MMP蛋白酶敏感的连接肽,形成抗CD47纳米抗体前抗体。采用DNA合成方法,分别合成CERX-连接肽与纳米抗体3D3-2和3C1融合的CD47纳米抗体前抗体(分别简称为3D3-2前抗体和3C1前抗体)基因,连接到表达载体上,构建p ET22b-CERX-3C1和p MECS-CERX-3D3-2重组质粒,转化BL21(DE3)大肠杆菌,进行IPTG诱导表达。Western blot检测目的蛋白的表达,非竞争ELISA方法检测目的蛋白与CD47结合特异性和亲和力,细胞ELISA和流式细胞术检测目的蛋白与表达CD47的Ec9706细胞的结合。结果表明,3C1前抗体和3D3-2前抗体重组基因均能在BL21(DE3)中表达,并在IMAC纯化中得到纯度约90%的重组蛋白。3C1和3C1前抗体均能与CD47蛋白和表达CD47的食管癌细胞Ec9706结合,且3C1前抗体与两者的结合活性均明显下降。虽然3D3-2和3D3-2前抗体与CD47蛋白可以结合,但均不与Ec9706细胞结合,在后续研究中不再采用。2.肿瘤组织对CD47纳米抗体前抗体的特异激活为了验证CD47纳米抗体前抗体是否被肿瘤组织特异激活,首先建立H22小鼠移植瘤模型,明胶酶谱法确定肿瘤组织匀浆液中的MMP-2,MMP-9的总酶活力,通过改变不同的孵育时间测定明胶酶和移植瘤组织匀浆液对前抗体的水解。Western Blot结果显示Ec9706细胞和H22细胞均表达MMP-2,MMP-9蛋白。酶活性测定表明肿瘤组织匀浆液酶活力为0.0149 U/μL。SDS-PAGE结果表明明胶酶和肿瘤组织匀浆液在37℃孵育7 h均可完全水解前抗体中连接肽。3.肿瘤特异激活的抗CD47纳米抗体对巨噬细胞促吞噬作用和毒性分析采用间接ELISA研究前抗体水解前后与CD47抗原的结合能力,流式细胞术和细胞ELISA确定前抗体水解前后与肿瘤细胞的结合能力,竞争ELISA方法检测前抗体水解前后对CD47蛋白结合SIRPα的阻断作用,血凝实验和溶血实验研究前抗体水解前后的毒副作用。采用分离得到的小鼠原代巨噬细胞检测前抗体水解前后对巨噬细胞吞噬能力的影响。结果表明水解后的3C1前抗体与CD47蛋白和表达CD47的肿瘤细胞结合活性与3C1接近,对CD47与SIRPα的结合也显示出与3C1相似的阻断活性。在凝集实验中,水解后的3C1前抗体对红细胞的凝集与3C1相似,并在补体存在下不会导致红细胞溶解,但对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞无影响。结论:综上所述,本研究成功构建了含有抑制性肽段的可被肿瘤组织匀浆液水解的抗CD47纳米抗体,并通过诱导表达,免疫印迹表明载体构建成功并能表达目的蛋白。在明胶酶和肿瘤组织匀浆液中水解7 h可完全水解前抗体中连接肽,水解后3C1前抗体显示出与3C1相似的抗原结合活性,与未水解的3C1前抗体相比抗原结合活性提高,能有效阻断CD47与SIRPα的结合,对红细胞的凝集作用强于未水解3C1前抗体。在补体存在下,不会引起红细胞溶解。