心肌肥厚是心肌细胞对多种损害心脏泵功能的病理性刺激的一种代偿性反应,藉此代偿性增加心脏的泵血功能。这些刺激信号可分为三类:力学信号、神经激素信号和细胞因子信号。如这些病理性刺激不能被及时去除,最终可致使心肌组织发生严重的病理改变,心功能受损,以至于心功能衰竭。因此,心肌肥厚的机制研究一直为心血管研究的热点。TNNI3K(cTnI-interacting kinase)是在心脏特异性表达的心肌激酶基因,它可能与心肌肌钙蛋白I和心肌肌动蛋白等肌小节收缩调节蛋白的功能有关,并可能通过一条未知的信号转导通路参与了对肌小节收缩蛋白的调控,进而调控心肌收缩能力。因此TNNI3K可能在超负荷心肌肥厚的发生过程中发挥重要作用。第一部分:TNNI3K在大鼠压力超负荷心肌肥厚模型的表达目的:观察在心肌肥厚的发生和发展过程中心脏的结构变化,及与TNNI3K的表达的相关性。方法:选用190-200g的成年雄性SD大鼠,随机分为:①假手术对照组(Con): 2周(Con2W)、4周(Con4W)、6周(Con6W);②模型组(Mod):2周(Mod2W)、4周(Mod4W)、6周(Mod6W)。大鼠压力超负荷心肌肥厚模型的制备参考Anversa P的方法。假手术对照组只分离左肾动脉上方的腹主动脉,并不结扎。其他步骤与模型组相同。1 HE染色观察心肌的形态结构将实验鼠麻醉后处死,取其心脏并将左心室分成两部分,一部分放入4%多聚甲醛固定液内固定。常规石蜡切片HE染色,于光学显微镜下观察形态变化,日本产Nikon光学显微镜下拍照。2电镜观察左心室的超微结构变化将另一部分左心室标本放入3%多聚甲醛和1%戊二醛混合固定液中固定。用于电镜观察左心室的超微结构变化。3免疫组织化学染色法观测TNNI3K基因表达变化将HE染色后剩余标本常规石蜡切片,做免疫组织化学染色,于光学显微镜下观察,日本产Nikon光学显微镜下拍照,并用图像处理软件(ImageProPlus6.0)进行图像分析。结果:腹主动脉缩窄术后2至6周,血流动力学和心脏重量指数均发生相应的变化,此外术后4-6周时,实验组大鼠左心室腔直径为7.38±0.43mm较对照组7.14±0.33mm略有增加,但左室壁厚则由3.8±0.45mm增至5.89±0.23mm,左心室的室壁厚度与室腔直径之比大于对照组,表明实验动物发生向心性肥厚。1左心室壁的组织学变化各对照组心肌纤维排列整齐,细胞的平均直径为9.7~9.9μm,胞核的平均直径为2.30~2.39μm。2周模型组的心肌细胞弥漫性肥大,其胞体平均直径为15.19±2.24μm,核深染,其平均直径为3.39±0.87μm。4周模型组的心肌细胞较2W更加肥大,其胞体平均直径为15.72±1.62μm,核的平均直径为3.46±0.16μm;心肌纤维走行紊乱,肌纤维间隙增宽,并可见间质纤维化。6周模型组,心肌细胞进一步肥大,其胞体平均直径为16.08±2.69μm,核的平均直径为3.65±0.15μm,肌纤维走行紊乱、断裂,间质纤维化严重。2大鼠左心室壁的超微结构变化各对照组大鼠心肌原纤维排列整齐,明带、暗带、Z线及闰盘清晰,肌节长约1.63μm。线粒体分布在心肌原纤维之间,多为椭圆形,呈串珠状排列,线粒体嵴清晰呈板层状排列,较稀疏。腹主动脉缩窄术后2周时:心肌原纤维整齐,闰盘和肌节清晰,肌节长1.83±0.08μm;线粒体逐渐增多,并出现集结现象,集结处线粒体多呈圆形,线粒体嵴排列密集;间质中微血管扩张,周细胞的胞核染色质凝聚成块状,并边聚化,提示早期凋亡。术后4周时:肌节长度与2周近似,长1.85±0.01μm。但线粒体集结现象增强,集结处线粒体数量增多,排列密集,线粒体嵴的形状和排列与2周组近似;细胞间质中除可见微血管扩张及早期凋亡的周细胞外,还可见晚期凋亡细胞,细胞核皱缩,其染色质凝聚,边聚化,出现凋亡小体。术后6周组时:肌节增长至1.94±0.09μm,线粒体集结处出现排列疏松区,线粒体嵴逐渐密集,线粒体嵴较其它组增厚;可以观察到死亡的心肌细胞,其胞膜崩解,大部细胞器溶解,可见少量外形完整的圆形线粒体,细胞核皱缩,染色质凝聚,并边聚化。3 TNNI3K基因的表达免疫组织化学分析表明, 2、4、6周各对照组心肌组织的TNNI3K基因的蛋白表达近似,其平均光密度为0.16 OD。腹主动脉缩窄术后2周时,TNNI3K基因的蛋白表达略低于对照组,但无统计学意义,其平均光密度为0.15±0.04 OD。术后4～6周时,TNNI3K基因的蛋白表达逐步增强,其平均光密度分别为0.17±0.02 OD和0.20±0.04 OD。结论:1腹主动脉缩窄术成功制备大鼠压力超负荷心肌肥厚模型。2随着心肌肥厚的出现及进展,间质纤维化逐渐加重,细胞凋亡增加。3 TNNI3K基因的可能在心肌肥厚的中后期发挥重要作用。第二部分:TNNI3K基因在乳鼠心肌细胞中的表达目的:观察AngⅡ对心肌细胞的形态影响及与TNNI3K基因表达的相关性。方法:取新生72小时内的SD仔鼠的心脏,应用含10%胎牛血清DMEM培养心肌细胞,制备细胞爬片。24h后换为无血清培养基,24h后实验组中加入AngⅡ(10μmol/L),对照组加入PBS,继续培养4天。之后以95%乙醇固定20min,细胞免疫化学染色,显微照相。应用(ImageProPlus6.0)软件分析图像,统计学处理所得数据。结果:经AngⅡ诱导的乳鼠心肌细胞肥大,其平均直径为42.48±1.91μm,面积为1546.428±633.61μm2,未经诱导细胞的平均直径为35.81±2.36μm,面积为1032.672±334.35μm2。提示AngⅡ诱导乳鼠心肌细胞肥大模型成功。经免疫组织化学染色,光密度分析显示,模型细胞中TNNI3K基因的蛋白表达增强,其累积光密度为202.86±74.40 OD。而对照组为147.41±52.32 OD。结论:TNNI3K基因参与了AngⅡ诱导的心肌细胞肥厚机制。