研究背景子宫内膜癌(Endometrial Carcinoma,EC)是女性生殖系统常见恶性肿瘤,占20～30%,致病模式与生活方式密切相关,并且在全球范围内趋向于患病率增加和患病年龄下降。40岁以下生育期EC患者所占比例上升至10%以上,常伴有长期无拮抗的雌激素治疗、肥胖、高血压、糖尿病、胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)、多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)。此类患者属于Ⅰ型EC的子宫内膜样腺癌,肿瘤分化程度较高,预后尚好,且大多为国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期中 Ⅰ 期 EC。年轻患者往往因需要手术切除子宫而失去生育功能。因此追求保留年轻EC患者生育能力和生理功能的治疗手段仍然是急待解决的问题。目前对于I型早期低危、欲保留生育功能的年轻EC患者,大剂量、长期应用高效孕激素治疗是临床首选。主要药物有醋酸甲羟孕酮(MPA,如倍恩),醋酸甲地孕酮(MA,如宜利治)。近些年来曼月乐(左炔诺孕酮宫内缓释系统,LNG-IUD)的使用增加了患者的接受度。但孕酮保守治疗即使成功也有一定的复发率,部分患者对孕激素不敏感或产生孕激素抵抗,且因其不良反应降低了依从性,临床应用受限。水飞蓟宾(silibinin,SB)是来源于水飞蓟属植物奶蓟(milk thistle)的提取物水飞蓟素中活性最强的生物成分,是天然的黄酮木脂素类化合物。在多年的临床实践中silibinin被称为“天然的保肝药物”。近年来科学家发现silibinin以多种信号途径为介导使肿瘤细胞增殖受抑,细胞周期停滞,细胞凋亡增加。它已作为抗癌药物进行Ⅱ期临床试验。信号转导和转录激活因子 3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是一种转录因子。它在肿瘤中异常激活,是多条致癌信号转换路径的汇聚点。在EC中STAT3改变靶基因的表达来影响细胞的增殖、分化和凋亡,对EC的发生、发展及预后密切相关。Agarwal等在前列腺癌(Prostate Cancer,PCA)中首先报道silibinin能减弱DU145细胞株STAT3的活化。此后,来自癌症模型的临床前数据和正在进行的临床试验证据均验证了 silibinin作为STAT3抑制剂在癌症中的作用。然而在EC中silibinin通过抑制STAT3发挥抗癌作用尚无研究报道。在当代,代谢综合征(Metabolic syndrome,MS)的发生率上升快速。流行学数据表明恶性肿瘤与MS密切相关,包含与性激素相关的乳腺癌(Breast Cancer,BC)、EC、PCA。其病理基础是中心性肥胖所致的IR和高胰岛素血症。脂代谢紊乱和IR是I型EC的高危致病要素。抑制异常脂代谢已成为EC治疗的一大关注热点。固醇调节元件结合蛋白家族(Sterol regulatory element-binding proteins,SREBPs)是调控哺乳动物胆固醇及脂肪酸(Fatty acid,FA)代谢的重要核转录因子。其中SREBP1是介入脂肪代谢和MS的关键调控基因。它的过表达将促使糖脂代谢紊乱,激发肥胖、IR、2型糖尿病和脂肪肝等疾患,并在多种脂质异常代谢的癌症尤其是激素敏感型BC、PCA、EC中显著上升。我们研究团队前期成果证实SREBP1在EC中较正常和不典型增生内膜显著增加,并且随EC细胞分化越差,表达越高,提示其在EC中的过表达与活化可能参与EC的进展。有研究表明silibinin可使MS患者获益,通过抗氧化应激,减轻脂毒性,增强胰岛素敏感性,并且能下调SREBP-lc及脂肪合成相关酶水平,干扰肝部脂类代谢,减缓IR。Nambiar等认为SREBP1可能成为silibinin的新靶点,在silibinin抑制PCA的作用中发挥关键作用。由此推测,作为具备抗肿瘤和抗代谢性疾病双重特性的药物,silibinin对SREBP1的抑制作用可望为早期低危I型EC的药物保守治疗提供新途径。本研究旨在揭示silibinin凭借STAT3和SREBP1为作用靶点,调控相应的信号途径,在抑制EC细胞增殖、促进细胞凋亡和减少异常脂质代谢方面发挥抗癌作用,为年轻早期低危I型EC患者的药物保守治疗提供新的选择和可行性,从而达到抑制肿瘤生长,延缓病情的目的,为保留生育功能创造机会。第一部分 水飞蓟宾调控STAT3通路干预Ⅰ型子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的机制研究目的:研究silibinin对I型EC细胞(Ishikawa和RL-952)的增殖、克隆形成能力、细胞凋亡和细胞周期的改变;检测两种细胞的STAT3、p-STAT3及与细胞凋亡、细胞周期相关的下游靶基因蛋白和mRNA水平的表达情况;探讨silibinin调控STAT3信号通路及其下游相关基因,抑制EC细胞增殖,促进其凋亡,从而抑制Ⅰ型EC发生发展的分子机制。方法:1.MTT法检测递增浓度silibinin对Ishikawa与RL-952分别处理24、48和72h后的细胞存活率。2.利用平板克隆形成实验测定silibinin干预Ishikawa和RL-952的细胞克隆形成能力。3.通过流式细胞仪观测silibinin对Ishikawa和RL-952细胞凋亡和周期的干预。4.不同浓度silibinin作用Ishikawa和RL-952细胞48小时后,应用蛋白免疫印迹(Western blot)检测两种细胞中STAT3、p-STAT3及下游靶基因Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、Survivin、CyclinD1、CyclinB1 的蛋白表达情况。5.不同浓度silibinin作用Ishikawa和RL-952细胞48小时后,应用qRT-PCR检测两种细胞中STAT3及下游靶基因Caspase-3、Bcl-2、Bax、Survivin、Ki67、CyclinD1、CyclinB1 的 mRNA 表达情况。结果:1.MTT法实验结果显示:silibinin使I型EC细胞(Ishikawa和RL-952)增殖明显受抑,且具有时间和剂量依赖性,PP<0.05,有统计学差别。Silibinin对两种细胞的 48 小时 IC50 值分别为 162 μmol/L(μM)和 136.7 μmol/(μM)。2.平板克隆形成实验结果显示:不同浓度silibinin处理后Ishikawa和RL-952的细胞克隆形成数目较空白组减少明显,P<0.01和P<0.05,有统计学差别。3.流式细胞术测定silibinin干预Ishikawa和RL-952细胞周期的效果呈示:与空白组比较,随着silibinin浓度提高,Ishikawa中G0/G1期细胞比例显著提高,P<0.001;RL-952的G2/M期细胞比例显著提高,P<0.001,有统计学差别。4.流式细胞术测定silibinin干预Ishikawa和RL-952细胞凋亡的效果呈示:随着silibinin浓度的增加,早期和晚期凋亡细胞百分比之和显著提高,与空白组对照,P<0.05和P<0.01,均有统计学差异。5.Western blot 检测 silibinin 对 Ishikawa 和 RL-952 细胞的 STAT3、p-STAT3及细胞凋亡相关蛋白、细胞周期调控蛋白的结果显示:silibinin干预48h后,与空白组对比,两种细胞的STAT3蛋白水平不变,而磷酸化STAT3的蛋白表达减少,P<0.05,有统计学差别;凋亡抑制相关蛋白Survivin和Bcl-2程度减弱,Bcl-2/Bax 比例减低,P<0.05,有统计学差别;Caspase-3蛋白表达减少,而Cleaved Caspase-3蛋白表达增加,P<0.05,有统计学差异;Ishikawa中CyclinD1的蛋白表达减少,而RL-952中CyclinB1的蛋白表达减少,P<0.05,有统计学差异。6.qRT-PCR检测silibinin对Ishikawa和RL-952细胞的STAT3及下游细胞凋亡相关和细胞周期调控基因mRNA水平表达的结果显示:与空白对照组对比,silibinin 作用 48 小时后,STAT3 的 mRNA 表达减少,Bcl-2/Bax、Survivin、Ki67的mRNA水平下调,P<0.01,有统计学差异;未激活的起始Caspase-3的mRNA水平下降,P<0.05,有统计学差异;Ishikawa中CyclinD1的mRNA表达减少,而RL-952中CyclinB1的mRNA表达减少,P<0.001,有统计学差异。结论:1.Silibinin显著抑制I型EC细胞的活力和增殖,且silibinin对Ishikawa和RL-952两种细胞的48小时IC50值分别为162 μM和136.7 μM。2.Silibinin对I型EC细胞Ishikawa和RL-952的克隆形成能力有明显抑制作用。3.Silibinin导致Ishikawa细胞周期阻滞在G0/G1期,而RL-952受阻在G2/M期。4.Silibinin显著促进Ishikawa和RL-952的细胞凋亡。5.从蛋白及mRNA水平验证silibinin明显抑制Ishikawa和RL-952细胞中STAT3磷酸化,调控其下游信号通路中细胞凋亡及细胞周期相关基因。6.研究证实silibinin能阻止STAT3活化,使Ⅰ型EC细胞增殖受抑、增进细胞凋亡、阻断细胞周期,有望成为靶点治疗Ⅰ型EC的新药物。第二部分水飞蓟宾调控SREBP1介导的Ⅰ型子宫内膜癌细胞异常脂代谢的机制研究目的:研究silibinin对Ⅰ型EC细胞(Ishikawa和RL-952)的SREBP1及其下游脂代谢相关靶基因的蛋白及mRNA水平的影响,检测silibinin作用后细胞核内SREBP1表达的变化及细胞内脂质合成与积累的变化,探讨silibinin通过阻断异常脂代谢途径对Ⅰ型EC发挥抗癌的分子机制。方法:1.Western blot检测SREBP1分别在Ishikawa和RL-952细胞中的蛋白表达情况,及150μM silibinin处理48小时后两种细胞中SREBP1蛋白表达的变化。2.不同浓度silibinin作用Ishikawa和RL-952细胞48小时后,应用Western blot检测SREBP1及下游靶基因ACLY、p-ACLY、SCD-1的蛋白表达情况。3.不同浓度silibinin作用Ishikawa和RL-952细胞48小时后,应用qRT-PCR检测 SREBP1、SCAP 及靶基因 FASN、ACLY、SCD-1、HMGCR 的 mRNA 水平的变化。4.采用细胞免疫荧光法检测高表达SREBP1的RL-952细胞经150 μM silibinin作用48小时后核SREBP1的表达情况。5.利用油红O实验测定150μM silibinin作用48h后脂滴在Ishikawa和RL-952细胞的分布情况。结果:1.Western blot 法测定 silibinin 影响 Ishikawa 和 RL-952 的 SREBP1 及下游靶基因蛋白表达的结果显示:SREBP1在RL-952细胞中蛋白表达水平高于Ishikawa细胞;Silibinin作用48小时后,随着浓度增加,与空白组对比,SREBP1及SCD-1、p-ACLY蛋白均有下降,PP<0.05,有统计学差异,而总ACLY蛋白水平无明显变化,P>0.05。2.qRT-PCR 检测 silibinin 对 Ishikawa 和 RL-952 中 SREBP1 和 SCAP 及下游脂代谢基因表达影响显示:silibinin作用48小时后,随着浓度增加,与空白组对比,SREBP1、SCAP的mRNA水平下降,PP<0.05,有统计学差别;下游基因FASN、ACLY、SCD-1和HMGCR的mRNA表达下调,P<0.05,有统计学差异。3.细胞免疫荧光法检测SREBP1高表达的RL-952细胞,经150 μM silibinin作用48小时后结果显示:与空白组相比,RL-952细胞的核SREBP1表达减少,采用免疫荧光平均光密度值分析方法得出平均光密度值降低,P<0.01,有显著统计学差别。4.油红O染色观测silibinin干预Ishikawa和RL-952细胞内脂质聚积的结果显示:经150μM silibinin作用48小时后,与空白组相比,Ishikawa和RL-952细胞内脂滴分布面积均明显减少,P<0.05,有统计学差异。结论:1.从蛋白及mRNA水平验证silibinin显著下调I型EC细胞Ishikawa和RL-952中脂代谢调控关键因子SREBP1和下游脂代谢相关基因,从而阻断SREBP1介导的异常脂代谢途径。2.Silibinin抑制了 RL-952细胞的核SREBP1的表达,减少了 Ishikawa和RL-952中脂质合成和积聚,表明其阻碍了 SREBP1参与转导的脂质合成和代谢作用。3.由此验证silibinin对Ⅰ型EC细胞具有抑制异常脂代谢作用,协同发挥抗癌特性。第三部分水飞蓟宾干预Ⅰ型子宫内膜癌肿瘤增殖和凋亡的体内实验目的:通过检测silibinin对采用Ⅰ型EC细胞RL-952造模的裸鼠皮下移植瘤的增殖和凋亡的影响,以及结合免疫组织化学法测定瘤体p-STAT3和SREBP1的表达,进一步验证silibinin对Ⅰ型EC的抗肿瘤机制。方法:1.选用RL-952细胞对BALB/c-nu小鼠进行皮下接种成瘤,建立人EC肿瘤模型,并观测silibinin给药后肿瘤体积和重量增长的变化。2.TUNEL测定silibinin给药后BALB/c-nu小鼠移植瘤组织中RL-952细胞凋亡现象。3.不同剂量silibinin给药后免疫组化法检测BALB/c-nu小鼠瘤体组织p-STAT3和SREBP1的表达情况。4.采用生化试剂盒测定各组裸鼠眼球血中谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、尿素氮(Bun)和肌酐(Cr)。结果:1.Silibinin给药后肿瘤测量显示:四组给予不同剂量(50、100、150、200 mg/kg)silibinin灌胃,与空白对照组比较,给药15天开始,各组瘤体生长体积出现减缓趋势,P<0.05,有差别;给药21天取瘤,50 mg/kg和100 mg/kg组瘤重减少没有差异,而150 mg/kg和200 mg/kg组瘤重明显减少,P<0.05,有统计学差异。2.TUNEL测定silibinin对BALB/c-nu小鼠移植瘤的细胞凋亡效应:不同剂量(50、100、150、200 mg/kg)silibinin作用后肿瘤细胞凋亡率与空白组对比,50和100 mg/kg组无明显增加,150和200 mg/kg组有显著增加,P<0.01,有统计学差异。3.免疫组织化学法测定各组瘤体p-STAT3和SREBP1表达情况显示:随silibinin剂量增加,各组肿瘤p-STAT3和SREBP1阳性表达量与空白组对照均有减弱趋势,且有显著性差异,P<0.01。4.各组裸小鼠眼球血GOT、GPT、Bun和Cr检测均无统计学差别,P>0.05。结论:1.Silibinin能减缓Ⅰ型EC异种成瘤增长,增进其组织的细胞凋亡。2.Silibinin能抑制裸鼠EC移植瘤中p-STAT3和SREBP1的表达。3.体内实验证明silibinin能通过减少STAT3活化和SREBP1激活抑制Ⅰ型EC发生发展,以实现其对Ⅰ型EC保守治疗临床应用的可行性。