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研究背景:脑出血是脑卒中的一种亚型,占所有脑卒中的10%～15%,以发病急、病情重、死亡率高为主要特点,脑出血死亡率约为40%,部分脑出血患者遗留严重的神经功能障碍。目前脑出血以降血压、脱水、营养神经等对症支持和手术治疗为主,但治疗效果欠佳。因此,寻找治疗脑出血的有效药物是脑卒中亟待解决的问题之一。脑出血局部水肿炎症引起细胞内环境代谢调节的紊乱,如氧化应激、内质网应激、线粒体损伤、兴奋性中毒、钙离子内流等,最终决定神经功能损伤程度。神经元细胞的死亡方式主要有自噬、凋亡、坏死三大类型,但没有明确的界限,神经元可以从其中一种死亡类型转变为其他类型。目前已有研究表明,脑出血诱导自噬的发生,损伤神经元细胞,而自噬抑制剂（3-MA）能抑制自噬,保护神经元细胞。丁苯酞作为一种神经营养药物,可通过改善循环、减轻脑水肿等途径,减少神经元损伤,在临床中已被广泛用于治疗缺血性脑卒中。已有研究报道NBP可通过激活Akt/m TOR信号通路抑制自噬及凋亡,改善脑缺血后灌注损伤,但其在脑出血自噬方面的研究尚未被报道。因此,我们选用H2O2氧化应激模型、谷氨酸兴奋毒性模型、小鼠脑出血模型,研究丁苯酞能否通过调控自噬发挥神经元细胞保护作用并探讨其在脑出血中的应用价值。研究目的:探究丁苯酞对神经细胞氧化应激及兴奋性中毒以及出血性脑损伤的保护作用及机制。研究方法:1.选用SH-SY5Y细胞作为本实验研究对象。（1）选用50μM、100μM、200μM、300μM、400μM不同浓度H2O2处理SH-SY5Y细胞,在镜下动态观察细胞形态变化,通过MTT法检测H2O2对SH-SY5Y细胞存活率影响;（2）选取10μM、20μM、40μM、80μM、100μM不同浓度丁苯酞直接处理SH-SY5Y细胞,镜下观察细胞形态变化,通过MTT检测NBP对SH-SY5Y存活率的影响;（3）使用NBP预孵SH-SY5Y 3h后,用200μM H2O2处理SH-SY5Y 2h构建氧化应激模型,镜下观察SH-SY5Y细胞形态改变,并使用MTT检测细胞存活率;（4）将SH-SY5Y细胞分为8组,分别为DMSO、NBP 40μM、NBP80μM、NBP 100μM、H2O2+DMSO、H2O2+NBP 40μM、H2O2+NBP80μM、H2O2+NBP100μM。DMSO/NBP直接处理SY5Y细胞5h;H2O2相关各处理组在DMSO/NBP预孵3h后,H2O2建模2h。收取蛋白样品,Western Blot检测Beclin-1、p62、LC3B及Caspase3、Caspase6蛋白表达水平。2.选用SD鼠小脑颗粒神经元（CGNs）作为研究对象。（1）使用50μM、100μM、200μM不同浓度的谷氨酸配制于25K培养基中处理CGNs 12h,镜下观察CGNs形态变化,使用Hochest33258染核统计核固缩;（2）将50μM、100μM、200μM不同浓度的NBP配于25K培养基中处理CGNs细胞12h,镜下观察CGNs形态变化,使用Hochest33258染核统计核固缩;（3）用50μM、100μM、200μM不同浓度的NBP和100μM谷氨酸共同处理CGNs 12h,镜下观察细胞形态变化,Hochest22358染色后观察核固缩情况,统计细胞凋亡率;（4）选用25μM、50μM、100μM、200μM不同浓度的NBP与100μM谷氨酸共同处理CGNs 12h后,收取蛋白样品,用Western Blot检测上测Beclin-1、p62、LC3B及Caspase3的蛋白表达水平。3.构建C57小鼠的脑出血模型。（1）分为Sham组、ICH组、ICH+NBP组,建模后30min分别腹腔注射植物油或者NBP,连续3天。3天后,对C57小鼠行Garcia评分评估小鼠运动感觉行为,取脑组织,冠状切面观察脑出血及脑血肿情况,判断模型构建情况;（2）取血肿周围脑组织匀浆,通过Western Blot检测脑血肿周围测Beclin-1、p62、LC3B及Caspase3蛋白表达水平；;（3）脑组织灌注后固定,荧光检测LC3B表达。研究结果:1.在H2O2氧化应激模型中,NBP抑制自噬,保护SH-SY5Y细胞。（1）镜下观察到SH-SY5Y存活细胞数随H2O2浓度升高而减少,MTT法检测发现SH-SY5Y细胞活力随H2O2浓度递增而递减,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）NBP不影响SH-SY5Y细胞形态及存活率（P>0.05）,提示该浓度范围NBP不影响活力;（3）在SH-SY5Y细胞的H2O2氧化应激模型中,NBP呈浓度梯度依赖改善SH-SY5Y细胞损伤,差异具有统计学意义（P<0.05）;（4）与对照组比较,H2O2导致Beclin-1、LC3BⅡ/LC3BⅠ表达升高,p62未见明显变化;与H2O2模型组相比,NBP处理组Beclin-1、LC3BⅡ/LC3BⅠ表达减少。2.在谷氨酸兴奋毒性模型中,NBP抑制自噬和凋亡,保护小脑颗粒神经元。（1）随谷氨酸浓度升高,CGNs胞体萎缩呈浓度梯度递增,Hochest33258统计核固缩率,谷氨酸处理组CGNs凋亡率呈浓度依赖增加,差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）NBP各浓度处理组CGNs细胞形态及核固缩率均未见明显变化（P>0.05）;（3）在CGNs谷氨酸兴奋毒性模型中,NBP减少谷氨酸引起的胞体萎缩和核固缩,差异具有统计学意义（P<0.05）;（4）与对照组比较,谷氨酸模型组Cleaved-Caspase3/Caspase3、LC3BⅡ/LC3BⅠ、Beclin-1表达增加,p62表达减少;与谷氨酸模型组相比,NBP处理组Cleaved-Caspase3/Caspase3、LC3BⅡ/LC3BⅠ、Beclin-1表达降低,p62表达先升高后降低。3.在小鼠脑出血模型中,NBP可抑制自噬及凋亡的发生,改善脑出血。（1）脑出血模型构建成功;（2）小鼠ICH组的Garcia评分较Sham组低（P<0.05）,结果表明小鼠的感觉和运动神经系统受损;NBP+ICH处理组的Garcia评分较ICH组稍高,差异有统计学意义（P<0.05）;（3）Western Blot结果显示,ICH组较Sham组Beclin-1、LC3BⅡ/LC3BⅠ、Cleaved-Caspase3蛋白表达均升高。与ICH组比较,NBP+ICH组的Beclin-1、p62、LC3B、Cleaved-Caspase3下降,提示自噬和凋亡抑制;（4）免疫荧光结果显示,ICH组LC3B表达上调,核周LC3B斑点聚集增加。相反地,ICH+NBP组LC3B核周斑点聚集减少。结论丁苯酞可通过抑制自噬改善神经细胞损伤和出血性脑损伤。