水稻(Oryza sativa L.)是世界最重要的粮食作物之一。上个世纪,以植物细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)为基础的“三系”杂交稻的利用使水稻的产量发生了飞跃的变化。目前,一方面由于世界人口的不断增长和耕地面积的不断减少,另一方面以病原菌和害虫等生物胁迫引起水稻的减产,使得目前世界的粮食问题尤为突出。因此,通过对作物品种的遗传改良以提高单位面积产量,将是解决人类对粮食的需求不断增加这一矛盾的主要途径。本研究在已有的HL-CMS不育相关片段HL-sp1分离和克隆基础上,利用TAIL-PCR技术进一步扩增其侧翼序列,对HL-sp1进行了结构和功能预测分析,并进行了遗传转化。采用RNAi技术以及亚细胞定位技术对稻瘟病抗性基因Pi36的功能进行了初步研究。取得了以下研究结果:1. HL-sp1侧翼序列的分析及基因预测采用单引物PCR以及改良的TAIL-PCR技术,成功地获得了HL-sp1 5’端2009 bp及3’端2555 bp的序列,将HL-sp1延伸至6740 bp。通过BLSAT序列比对,发现HL-sp1缺失了线粒体基因atp6的1-1772 bp,而且5’端近1700 bp序列与籼稻9311的线粒体序列同源性非常小,而与玉米的T-CMS和C-CMS线粒体DNA序列有部分的同源性。利用2种基因预测软件RiceGAAS (http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)和Softberry的FGENESH (http://www.softberry.com)对HL-sp1进行了基因预测及注释分析。结果表明该序列包含2个ORFs。第一个ORF全长171bp,由4个不连续的较短的外显子组成,编码一个功能未知的蛋白;另外一个ORF由651bp组成,是一个独立的外显子,编码216个氨基酸,暂命名这个候选基因为orf216,通过与9311线粒体序列比对发现,orf216是由2个相差较远的基因的部分编码区和一个未知片段所组成的嵌合基因。2. HL-CMS不育候选基因orf216的细胞质特异性及表达分析以不育候选基因orf216的序列设计了特异性引物对水稻3种不同CMS类型的不育系、保持系、恢复系及杂交种进行PCR分析,证明不育候选基因orf216只存在于具有红莲型不育胞质的品种中。进一步利用反转录PCR对不育候选基因orf216进行了表达模式分析,初步结果表明该基因为组成型表达。3. HL-CMS相关不育候选基因orf216的克隆与遗传转化利用已经克隆的BT型水稻育性恢复基因Rf1b的线粒体定位信号肽序列和双元载体转化体系pCAMBIA1305.1,成功地构建了重组植物表达载体。以与红莲型不育系粤泰A(YTA)同核异质的保持系粤泰B(YTB)作为受体,通过农杆菌介导的遗传转化体系进行了候选基因的遗传转化,获得了一定数量的转化植株。对T0代转化植株进行了选择标记潮霉素基因和目的基因的PCR分子检测。结果表明候选基因成功地插入受体品种的基因组中。4.稻瘟病抗性基因Pi36 RNAi干涉载体的构建与遗传转化利用植物干涉表达载体pCAMBIA1300RS成功地构建了Pi36的5’端、3’端和NBS保守结构域的3个植物RNA干涉表达载体,分别将这些重组载体转化至农杆菌菌株EHA105后,对水稻抗病品种Q61进行遗传转化。经过分子鉴定后,获得了一批阳性转化植株。荧光定量PCR分析表明,3个干涉载体的转化植株中目的基因Pi36的表达量均有不同程度的下降,其中以ORF 5’端的片段构建的载体干涉程度最强。5.稻瘟病抗性基因Pi36亚细胞定位载体的构建与遗传转化将Pi36 ORF 1-1827 bp的序列通过NcoI和BglII酶切位点插入植物表达载体pCAMBIA1302,在35S强启动子的控制下在洋葱表皮细胞进行瞬时表达,结果表明Pi36基因的产物定位于细胞核。同时重组载体利用农杆菌介导法对烟草进行遗传转化,选取转化苗根尖进行观察,结果与瞬时表达一致。