【摘 要】
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目的:本研究基于衰老状态下学习记忆功能减退在中医学中的表现和发生机制,提出MCI滋肾宁心化痰法的治疗法则,初步阐明滋肾宁心化痰法代表方剂孔圣枕中丹在体内、体外改善MCI谷氨酸能突触可塑性损伤的作用及机制,以期发现MCI潜在的治疗靶点,为临床提供参考依据。方法:细胞实验:以Aβ25-35诱导SH-SY5Y制备体外细胞模型,MTT法检测Aβ25-35最佳作用浓度和时间;CCK8法检测含药血清对Aβ25
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目的:本研究基于衰老状态下学习记忆功能减退在中医学中的表现和发生机制,提出MCI滋肾宁心化痰法的治疗法则,初步阐明滋肾宁心化痰法代表方剂孔圣枕中丹在体内、体外改善MCI谷氨酸能突触可塑性损伤的作用及机制,以期发现MCI潜在的治疗靶点,为临床提供参考依据。方法:细胞实验:以Aβ25-35诱导SH-SY5Y制备体外细胞模型,MTT法检测Aβ25-35最佳作用浓度和时间;CCK8法检测含药血清对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞相对生存率的影响,光镜下观察含药血清对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞形态和轴突长度的影响,确立含药血清的最佳浓度和作用时间,取相同浓度空白血清作为后续实验空白对照组;将细胞分为空白组、Aβ25-35组、空白血清+Aβ25-35组、空白血清+H-89+Aβ25-35组、空白血清+Sp-c AMP+Aβ25-35组、含药血清+Aβ25-35组、含药血清+H-89+Aβ25-35组、含药血清+Sp-c AMP+Aβ25-35组,给药时间48h;Elisa法测定细胞上清液谷氨酸含量;Western blot法检测PKA c-β、p-CREB、BDNF、Glu A2、Glu N1、Glu N2A蛋白表达水平;免疫荧光法检测SYP、PSD-95蛋白表达水平。动物实验:以7月龄SAMP8小鼠为研究对象,同月龄SAMR1小鼠为对照组。适应性饲养7天后,对所有小鼠进行Morris水迷宫训练,筛选出具有学习记忆障碍表现的SAMP8小鼠40只,随机分为模型组、孔高、孔中、孔低剂量组,每组10只;对照组为10只SAMR1小鼠。孔高、孔中、孔低剂量组分别以9.2g/kg·d、4.6g/kg·d、2.3g/kg·d的剂量给予孔圣枕中丹混悬液灌胃,对照组和模型组小鼠给予同体积蒸馏水,连续灌胃给药28+4天,每日一次。给药第28天对各组小鼠进行Morris水迷宫测试;镜下观察各组小鼠海马CA1区锥体神经元Golgi-cox染色的形态变化,采用Image J软件分析测量树突棘密度;透射电镜观察各组小鼠海马CA1区神经元和突触结构形态变化;免疫组化检测各组小鼠海马CA1区SYP和PSD-95蛋白表达水平;Western blot检测各组小鼠海马组织SYP、PSD-95、c AMP、PKA c-α、CREB、p-CREB、Glu A2、Glu N1、Glu N2A蛋白表达水平。结果:1.确立Aβ25-35最佳造模浓度为30μM,含药血清最佳作用浓度为20μM,最佳作用时间为48h;含药血清可上调PKA-CREB-BDNF信号通路相关蛋白表达,升高谷氨酸能突触受体蛋白Glu A2、Glu N1、Glu N2A及突触可塑性相关蛋白SYP、PSD-95的表达水平,增加细胞突触间谷氨酸释放,改善SH-SY5Y细胞形态和轴突长度。2.滋肾宁心化痰中药孔圣枕中丹能够改善SAMP8小鼠学习记忆能力;减少SAMP8小鼠海马CA1区锥体神经元丢失,增加树突棘的密度,改善突触结构可塑性,具有认知功能保护作用;滋肾宁心化痰中药孔圣枕中丹能够增加谷氨酸能突触结构中突触后膜厚度,升高SYP、PSD-95蛋白表达水平,对突触功能的正常发挥有保护作用;滋肾宁心化痰中药孔圣枕中丹对SAMP8小鼠海马c AMP、PKA c-α、p-CREB/CREB和谷氨酸能突触受体蛋白Glu A2、Glu N1、Glu N2A表达均有上调作用,提示滋肾宁心化痰中药孔圣枕中丹可促进MCI谷氨酸能突触受体的功能恢复、提高传递效能,这种作用可能是通过调节c AMP-PKA-CREB通路而实现的。上述作用呈现剂量依赖性,最高剂量为最佳。结论:1.滋肾宁心化痰法能通过改善SH-SY5Y细胞和海马神经元突触可塑性损伤,发挥治疗MCI的作用;2.滋肾宁心化痰法能通过上调突触前膜c AMP-PKA-CREB/BDNF信号通路,增加SYP蛋白功能发挥,促进前膜释放兴奋性神经递质Glu,激活突触后NMDAR和AMPAR亚基功能和突触可塑性蛋白PSD-95的表达,从而发挥记忆保护作用。
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