蛋白质分子是细胞活动的基础,正确的空间结构是其发挥正常生理功能的先决条件。在某些条件下,蛋白质可发生错误折叠而导致淀粉样纤维化。淀粉样纤维沉积是很多人类疾病,如亨廷顿氏病、糖尿病、帕金森病以及阿尔兹海默症等的共同特征之一。尽管蛋白质在序列、长度、折叠状态、前体蛋白结构方面有很大的差异,但它们在发生错误折叠后形成的淀粉样纤维具有高度相似的结构,形成淀粉样纤维几乎是所有蛋白质的共性。研究表明,蛋白质淀粉样纤维化一般经历三个动力学过程,即形成具有淀粉样性质的晶核,在晶核的基础上延伸形成纤维以及转变为成熟纤维,分别对应于生长动力学曲线的滞后期、生长期和稳定期。很多因素如温度、酸度、离子强度、金属离子以及一些小分子化合物等都能够对蛋白质纤维化产生影响。对蛋白质的氧化也可以使蛋白质的结构和性能发生变化,从而影响其纤维化过程。本文以牛胰岛素和鸡蛋清溶菌酶为模型蛋白,分析氧化作用对蛋白质的结构及其淀粉样纤维化过程的影响,并对相关的分子机制以及纤维细胞毒性进行探索。主要研究方法及结果1.H2O2对蛋白质的氧化作用以H2O2作为氧化剂,与溶菌酶作用一定时间后,透析除去多余的H2O2,以纯溶菌酶作为对照,研究蛋白质的结构及纤维化行为的改变。紫外光谱显示,溶菌酶分子中的芳香族氨基酸不受H2O2氧化作用的影响;而内源荧光光谱证实,经H2O2作用后溶菌酶分子三级结构发生了变化,且三级结构的变化程度与H2O2浓度呈正相关。此外,蛋白质变性实验结果表明,氧化溶菌酶分子更易受到变性剂的作用,变性过程属于“多态模型”,而非氧化溶菌酶的变性过程则属于“三态模型”。与溶菌酶不同,牛胰岛素在H2O2的作用下,紫外光谱和内源荧光光谱都基本保持不变,质谱分析显示,牛胰岛素的氧化涉及一个加氧过程。2.经H2O2处理后蛋白的淀粉样纤维化行为本文主要采用ThT和ANS荧光标记、刚果红光谱和圆二色谱检测蛋白质的淀粉样纤维化过程。结果表明,非氧化胰岛素和溶菌酶在淀粉样纤维化生长过程中,ThT曲线呈“S”型,蛋白的α-螺旋逐渐减少,β-折叠和表面疏水性逐渐增加。与之比较,经H2O2氧化后,蛋白质淀粉样纤维化趋势明显下降。透射电子显微镜结果表明,孵育成熟的纯蛋白质纤维具有浓密的线状形态,而经过H2O2氧化后,纤维密度及长度均明显降低,说明H2O2对蛋白的氧化作用可抑制蛋白质的淀粉样纤维化。3.AAPH对蛋白质的氧化作用及其对蛋白质淀粉样纤维化的影响AAPH常被用作水溶性的自由基源。将AAPH作为另一种氧化剂加入到蛋白溶液中,在37℃下作用不同时间后,透析除去未反应的AAPH,并以纯蛋白作为对照。光谱数据表明,AAPH使蛋白质中的芳香族氨基酸发生氧化,导致紫外光谱和内源荧光发生变化,说明蛋白质的结构发生了改变。经AAPH氧化后,蛋白质淀粉样纤维化趋势明显减小。透射电子显微镜下,蛋白在孵育6天后可观察到大量聚集体颗粒,纤维密度明显减小,即蛋白的淀粉样纤维化过程被抑制。非变性电泳结果表明,经AAPH处理后,蛋白单体发生交联,产生多聚体,这种多聚体使蛋白的纤维化趋势降低。4.纤维的细胞毒性以人红细胞作为体外模型,探索并比较氧化和非氧化蛋白经孵育形成的聚集体的细胞毒性。结果表明,由非氧化蛋白形成的纤维具有较强的细胞溶血作用,而经H202和AAPH处理后,氧化蛋白形成的纤维聚集体对细胞的溶血作用明显降低,该结果在细胞形态观察中得到了进一步证实。结论:牛胰岛素和溶菌酶在经历H202和自由基的氧化作用后,其分子结构发生了改变,进而使蛋白质淀粉样纤维化过程发生变化。这些变化主要体现在延长了纤维形成的成核期,并降低了蛋白在淀粉样纤维化过程中聚集体的表面疏水性,从而使纤维的细胞毒性作用降低。虽然上述两种氧化剂对蛋白质的作用机制不同,但最终的结果都是蛋白质被氧化后,淀粉样纤维化行为得到了明显的抑制。其主要原因是氧化作用使蛋白质原有的构型发生变化,或者生成多聚体,从而使形成淀粉样纤维化的条件受阻。本文的结果对于进一步探索氧化胁迫条件下蛋白质淀粉样纤维化的分子机制具有重要意义。