[研究目的]阿尔兹海默症(AD)病理特征复杂,Aβ的聚集和沉积是诱发AD病理进程的首要环节。越来越多的证据表明可溶性的Aβ寡聚体(ADDLs)是产生神经毒性的主要元凶。而衰老是神经退行性疾病的主要危险因素之一,D-半乳糖可以诱导脑老化从而影响神经元功能导致记忆损伤。因此,我们首先选用D-半乳糖诱导老化,模拟人体后期大脑中可溶性的Aβ寡聚体增加并进行联合造模,其次,通过秀丽隐杆线虫寿命实验发现抗衰老作用的中药单体作用于上述模型,研究其保护神经元、增强学习记忆相关的作用机制。此外,采用APP/PS1转基因的AD模型小鼠,进一步验证其对突触结构以及记忆、情绪行为的保护作用。[研究方法]1、秀丽隐杆线虫药物筛选:本研究采用N2野生型秀丽隐杆线虫(C.elegans)研究生地黄、熟地黄、人参、天冬、牛膝这五味中药对其寿命的影响。筛选出具有延长寿命作用的中药及其对应单体,进行下一步实验。2、体外神经元实验:选用ADDLsl-42孵育并鉴定,得到可溶性的Aβ寡聚体,联合D-半乳糖作用于皮层神经元细胞,显微镜下进行形态观测,并用MTT法检测细胞活性,Western Blot进一步检测其对突触蛋白表达的影响。3、体内D-半乳糖和ADDLs联合诱导突触损伤的小鼠实验:首先采用腹腔注射D-半乳糖再侧脑室注射ADDLs的联合方法建立神经突触损伤的AD模型小鼠,并给予人参皂苷Re治疗,每周监测体重指标,通过行为学实验探究其对突触损伤小鼠空间学习记忆、恐惧记忆的影响。采用Western Blot实验检测人参皂苷Re对半乳糖联合ADDLs诱导神经突触损伤小鼠突触蛋白的作用。最后,利用GC-MS分析技术和PCA、OPLS-DA等多元数据处理方法对小鼠血清进行差异性代谢物的分析,从而寻找出参与调节发挥保护作用的代谢途径。4、体内APP/PS1转基因Aβ-AD小鼠实验:四月龄APP/PS1小鼠给药人参皂苷Re,每月监测体重、血糖及口服糖代量的变化,并监测小鼠血清中T-CHO、TG、LDL-C脂代谢指标的变化,最后,通过棉花压片筑巢和Morris水迷宫行为学实验作进一步探究。[研究结果]在药物延长线虫寿命的实验中,通过观察给药后线虫的生存时间,我们发现生地、熟地、人参的水和醇提物均可以延长线虫寿命,天冬、牛膝的水和醇提物都不能延长N2野生型秀丽隐杆线虫的寿命,从0.5 mg/ml到5 mg/ml反而显示剂量依赖性的缩短线虫寿命的作用。寿命延长效果:人参>熟地黄>生地黄,醇提物生物活性大于水提物,人参醇提物最大延长寿命30.33%,并且人参皂苷中的单体Rbl以及Re均能够显著延长线虫寿命,人参皂苷Re显示延长寿命效果最佳。孵育Aβ1-42多肽制备ADDLs,经过凝胶电泳、快速银染实验证实三聚体和四聚体的形成。体外培养的小鼠大脑皮层神经元在终浓度30 mM半乳糖作用下,细胞活性显著下降,突触结构遭到破坏。当30 mM的半乳糖和1 μM的ADDLs联合作用小鼠大脑皮层神经元细胞48h后,神经元细胞体死亡,细胞活性相对于单个的半乳糖或是ADDLs均表现出进一步下降。同时Western Blot结果显示,30 mM的半乳糖和1 μM的ADDLs联合培养神经元,能够减少NR2B蛋白表达,增加了NR1蛋白表达,对AMPK蛋白的表达没有影响,AMPK磷酸化蛋白表达显著降低。腹腔注射半乳糖和侧脑室注射ADDLs后增加损伤小鼠空间记忆,损伤了大脑学习记忆功能;给药人参皂苷可以有效缩短小鼠寻找平台的空间探索时间,保护小鼠学习记忆能力。腹腔注射半乳糖和侧脑室注射ADDLs的模型组小鼠显示条件恐惧记忆损伤,人参皂苷Re低剂量能保护其恐惧记忆。人参皂苷Re能抑制半乳糖联合ADDLs诱导小鼠突触蛋白表达异常和突触功能损伤。经GC-MS测定分析显示其谷氨酸代谢途径发生了改变。人参皂苷Re对APP/PS1小鼠的体重、血糖均没有影响,人参皂苷Re可以纠正APP/PS1小鼠糖代谢异常,但不能完全逆转。人参皂苷Re可以通过降低血清中的血清胆固醇、甘油三脂以及低密度脂蛋白水平从而调节小鼠脂代谢的异常。人参皂苷低剂量给药有效保护了小鼠的空间学习记忆能力、提升筑巢能力。[研究结论]天冬和牛膝提取物均不能延长秀丽隐杆线虫的寿命,生地黄、熟地黄、人参均能够很好地延长秀丽隐杆线虫的寿命,熟地黄延长寿命率大于生地黄,醇提物要比水提物延长作用更好;人参中的总皂苷成分以及人参皂苷Rb1、Re在小剂量时均能显著提高寿命,延长率低于全药材提取物,Re>Rbl>总。我们应用人工合成的Aβ1-42多肽制备了ADDLs,MTT实验证实了其对神经元具有一定的损伤作用,联合半乳糖后可以进一步加剧细胞和突触损伤、影响突触蛋白表达,成功制备突触损伤的神经元细胞模型。小鼠经腹腔注射半乳糖加速老化后,再联合侧脑室注射Aβ后显示明显的学习记忆、恐惧记忆能力下降、突触损伤,AD小鼠模型成功建立,人参皂苷Re对前述AD小鼠的空间学习记忆、恐惧记忆均具有显著的保护作用。同时,人参皂苷Re调节APP/PS1小鼠的糖代谢,脂代谢,行为学的异常。